Preview

Вестник урологии

Расширенный поиск

Изменения фенотипа канальцевого эпителия нефрона контрлатеральной почки при односторонней непроходимости мочеточника (экспериментальное исследование)

https://doi.org/10.21886/2308-6424-2021-9-3-5-11

Полный текст:

Аннотация

Введение. Широкое распространение заболеваний почек, вызванных обструкцией мочевых путей, привело к необходимости экспериментальных исследований закономерностей развития компенсаторных и патологических процессов при их поражении. Актуальным является изучение ключевых механизмов, обеспечивающих выполнение компенсаторных функций контрлатеральной почкой, для ранней диагностики, лечения и прогноза обструктивных заболеваний почек.

Цель исследования. Изучить изменения фенотипа эпителиальных клеток нефрона контрлатеральной почки при односторонней непроходимости мочеточника на экспериментальной модели.

Материалы и методы. Модель односторонней непроходимости мочеточника воспроизведена на взрослых кроликах. Исследования проведены на 7-е, 14-е и 21-е сутки полной обструкции левого мочеточника. Выполнено иммунофенотипирование образцов ткани контрлатеральной почки на маркеры эпителиального фенотипа (цитокератин 7, Е-кадгерин) и мезенхимального фенотипа (виментин, гладкомышечный актин).

Результаты. Контрлатеральная почка при дополнительной нагрузке способна длительно сохранять морфофункциональные характеристики нефрона. Первые признаки изменения фенотипа эпителия нефрона зарегистрированы на 21-е сутки в виде появления диффузной визуализации маркера мезенхимального фенотипа (виментина), на фоне абсолютного сохранения визуализации маркеров эпителиального фенотипа.

Заключение. Полученные результаты позволяют полагать, что при увеличении срока обструкции адаптационный резерв контрлатеральной почки постепенно снижается, что повышает риск развития событий по негативному сценарию.

Для цитирования:


Акименко М.А., Воронова О.В., Колмакова Т.С. Изменения фенотипа канальцевого эпителия нефрона контрлатеральной почки при односторонней непроходимости мочеточника (экспериментальное исследование). Вестник урологии. 2021;9(3):5-11. https://doi.org/10.21886/2308-6424-2021-9-3-5-11

For citation:


Akimenko M.A., Voronova O.V., Kolmakova T.S. The changes of the tubular epithelium phenotype in the contralateral kidney nephrons while developing unilateral ureteral obstruction: an experimental study. Vestnik Urologii. 2021;9(3):5-11. (In Russ.) https://doi.org/10.21886/2308-6424-2021-9-3-5-11

Введение

Широкое распространение заболеваний почек, вызванных обструкцией мочевых путей, привело к необходимости экспериментальных и клинических исследований механизмов и закономерностей развития компенсаторных процессов при их поражении [1][2][3][4][5][6][7]. Почка является узкоспециализированным, сложным органом и обладает способностью восстанавливать свою функциональность после некоторой степени повреждения [8]. Существует понятие почечного противовеса, который представляет собой феномен повышенной функциональной нагрузки на первоначально неповреждённую почку пропорционально снижению функции, повреждённой в результате односторонней непроходимости мочеточника (ОНМ) [9][10]. Однако, морфологические и функциональные изменения в контрлатеральной почке изучены недостаточно. Между тем данные литературы позволяют полагать, что изменения в неповреждённой почке отражают адаптации органа не только к возросшей нагрузке, но и направлены на поддержание гомеостаза организма в целом на фоне развивающегося окислительного стресса и митохондриальной дисфункции вследствие ОНМ [11][12][13].

Механизмы, лежащие в основе адаптационной способности почек, все ещё остаются предметом дискуссий и в качестве одного из таких механизмов рассматривается эпителиальномезенхимальный переход (ЭМП). В процессе ЭМП происходит изменение формы, потеря полярности, повышение подвижности эпителиальных клеток, связанные с увеличением производства в них коллагена, и образуются высокоинвазивные, мигрирующие, веретенообразные, удлинённые мезенхимные клетки [14]. Изменения полярности и морфологии клеток сопровождаются снижением экспрессии маркеров эпителиального фенотипа и появлением мезенхимальных маркеров [15][16]. Утрата признаков тканевой дифференцировки клеток, несомненно, отражается на функции органа в целом.

Следовательно, поиск ключевых процессов, приводящих к необратимому повреждению обструктивной почки, а также процессов, обеспечивающих выполнение компенсаторных функций контрлатеральной почкой, является важной задачей для более точной диагностики, лечения и прогноза обструктивных заболеваний почек. Использование экспериментальной модели даёт возможность проследить последовательность изменений как в поражённой, так и в контрлатеральной почке в динамике обструкции [17][18].

Цель исследования – изучить изменения фенотипа эпителиальных клеток нефрона контрлатеральной почки при ОНМ на экспериментальной модели.

Материалы и методы

Экспериментальная модель ОНМ воспроизводилась на взрослых кроликах самцах в возрасте 3,5 месяцев, весом 2,4 – 2,75 кг по методике E. Giamarellors-Bourbalis et al. [19]. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей, Федерацией европейских ассоциаций по науке о лабораторных животных и Международным советом по науке о лабораторных животных. Исследования были разрешены локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО РостГМУ (протокол №21/15 от 10.12.2015 года). В зависимости от срока эксперимента кроликов разделили на 4 группы по 6 животных в каждой: первая группа – контрольная, вторая группа – 7 суток обструкции мочеточника, третья группа – 14 суток и четвёртая – 21 сутки механической обструкции левого мочеточника.

Для морфологических исследований образцы ткани контрлатеральных почек фиксировали 10% забуференным нейтральным формалином с дальнейшей гистологической проводкой, заключением в парафиновые блоки и микротомией. Серийные срезы тканевых образцов окрашивали гематоксилином и эозином по классическому протоколу для дальнейшей микроскопии и анализа морфологических изменений. Для оценки морфометрических показателей контрлатеральных почек готовые гистологические препараты сканировали на сканере гистопрепаратов (Aperio CS2 Leica, Germany) с увеличением в 40 раз. На полученных изображениях в программе Aperio ImageScope (v. 12.4.0) при помощи встроенных инструментов и шкалы измеряли структуры нефрона.

Иммунофенотипирование образцов ткани контрлатеральной почки проводили на маркеры эпителиального и мезенхимального фенотипов с использованием первичных моноклональных мышиных антител. В качестве маркеров эпителиального фенотипа использовали Anti-Cytoceratin 7 (СК7) (Abcam 9021, USA, разведение 1:200) и Anti-Е-cadgerin (Abcam 233766, USA, разведение 1:150). Признаки мезенхимального фенотипа определяли с использованием Vimentin antibody (Vim) (Biorbyt 317381, UK, разведение 1:200) и Smooth Muscle Actin antibody (α-SMA) (Biorbyt 334169, UK, разведение 1:250). Визуализацию образовавшихся комплексов антиген-антитело проводили на системе детекции EnVision FLEX (Dako, Дания).

Микроскопию и фотосьёмку образцов осуществляли на автоматической системе со светодиодной подсветкой Leica DM4000 B LED (Германия). Результаты ИГХ-реакций оценивали по интенсивности окрашивания каждого из маркеров.

Результаты

К 7-м суткам эксперимента зарегистрировано незначительное уменьшение мочевого пространства в почечном тельце нефрона за счёт увеличения площади сосудистого клубочка. Через две недели развития ОНМ в компенсаторной почке определены дистрофические изменения канальцевого аппарата в виде гиалиново-капельной и гидропической дистрофии. В клубочках отмечено увеличение площади и диаметра почечного тельца в сравнении с контролем и незначительное уменьшение просвета проксимального канальца за счёт увеличения высоты эпителия. На 21-е сутки ОНМ выявлены изменения в строме почечной ткани в форме сетчатого фиброза, локализующегося между отдельными канальцевыми структурами мозгового вещества почки. Морфометрически показано, что на фоне изменений в клубочковой зоне и проксимальных канальцах появляются изменения в дистальных канальцах в виде увеличения высоты эпителия.

Иммунофенотипирование контрлатеральной почки показало, что экспрессия эпителиальных маркеров (Е-кадгерин и СК7) на протяжении всего эксперимента поддерживалась на уровне, сопоставимом со здоровой почкой. В динамике эксперимента Е-кадгерин определялся в канальцевых сегментах нефрона контрлатеральной почки как в проксимальных, так и дистальных канальцах (рис. 1 А). Визуализацию СК7-позитивных клеток регистрировали как в эпителии канальцевых сегментов нефрона, так и в эпителии собирательных трубочек на всех сроках эксперимента (рис. 1 В).

На всех сроках ОНМ количество α-SMA позитивных клеток соответствовало контролю (рис. 2 А). Однако, к 21-м суткам эксперимента была зафиксирована визуализации виментина не только в почечном тельце, что является нормой, но и диффузно в проксимальных канальцах нефрона контрлатеральной почки (рис. 2 В). Таким образом, к 21-м суткам ОНМ на фоне адекватной экспрессии эпителиальных маркеров регистрировалось появление маркера мезенхимального фенотипа, что свидетельствует о реакции эпителия нефрона на увеличение нагрузки.

Рисунок 1. Фенотип эпителия нефрона контрлатеральной почки на 21-е сутки односторонней непроходимости мочеточника:
А – экспрессия Е-кадгерина в эпителии дистальных извитых канальцев (ув. х400); В – экспрессия СК7 в эпителии собирательных трубочек и канальцевых структурах нефрона (ув. х400)
Figure 1. The phenotype of the contralateral kidney nephron epithelium by day 21 of unilateral ureteral obstruction.
A – expression of E-cadherin in the distal convoluted tubules epithelium (magn. x400); B – CK7 expression in the collecting ducts epithelium and nephron tubular structures (magn. x400)

Рисунок 2. Фенотип эпителия нефрона контрлатеральной почки на 21-е сутки односторонней непроходимости мочеточника:
А – отсутствие экспрессии маркера α-SMA в ткани контрлатеральной почки (ув. х400); В – диффузная экспрессия маркера Vim в канальцевых структурах нефрона (ув. х400)
Figure 2. The phenotype of the contralateral kidney nephron epithelium by day 21 of unilateral ureteral obstruction.
A – absence of expression for the α-SMA marker in the contralateral kidney tissue (magn. x400); B – a diffuse expression of the Vim marker in the nephron tubular structures (magn. x400)

Следовательно, диффузная визуализация мезенхимального маркера виментина в эпителии канальцевой части нефрона контрлатеральной почки на 21-е сутки ОНМ синхронизируется с зарегистрированными морфометрическими и гистологическими изменениями в виде гидропической и гиалиново-капельной дистрофии в этих же структурах.

Обсуждение

Увеличение функциональной нагрузки на контрлатеральную почку вследствие ОНМ является фактором стресса для эпителиальных клеток почечных канальцев. Проведённое нами иммуногистохимическое исследование выявило молекулярно-биологические изменения в эпителии нефрона. Эти результаты взаимосвязаны с ранее полученными показателями морфологического исследования контрлатеральной почки в динамике ОНМ [20]. В частности, в течение двух недель эксперимента не зарегистрировано изменений иммунофенотипа эпителия нефрона контрлатеральной почки, в свою очередь морфологические изменения носят адаптивный характер, не выходя за рамки физиологической нормы с учётом увеличения нагрузки на компенсаторный орган. Данные иммуногистохимического исследования эпителиального фенотипа, а именно визуализация СK7 и чёткая экспрессия E-кадгерина в эпителии канальцев нефрона на протяжении всех сроков эксперимента, подтверждают сохранение структурной целостности эпителиоцитов и межклеточной адгезии эпителиального пласта канальцевых структур, а следовательно, и поддержание эффективности, выполняемой ими функции. Основанием для этого вывода служат данные о важной роли мембранного белка E-кадгерина в сохранении целостности и полярности почечного эпителия, а также в поддержании межклеточной адгезии во всех отделах нефрона [21][22]. В свою очередь эпителиальные кератины служат чувствительными индикаторами стресса, они обеспечивают структурную и механическую целостность эпителиоцитов, однако снижение их экспрессии увеличивает восприимчивость эпителия к повреждению, а их потеря считается характерным признаком ЭМП [23][24]. Визуализация в компенсаторной почке двух высокоспецифичных эпителиальных маркеров позволяет говорить о сохранности эпителия нефрона в течение всего периода эксперимента и успешной физиологической адаптации органа к возросшей нагрузке.

Появление маркера мезенхимального фенотипа виментина к 21-м суткам ОНМ можно расценивать как начальный этап процесса перестройки цитоскелета эпителиальных клеток канальцев нефрона в ответ на увеличение нагрузки. Существует мнение, что даже незначительные изменения фенотипа эпителиальных клеток указывают на формирование процессов адаптации нефрона к сверхнагрузке, в том числе и через ЭМП. По утверждению T. Seccia et al. экспрессия мезенхимальных белков в эпителии нефрона отражает стресс-устойчивость почки в условиях повышенной нагрузки и её способность продолжать поддерживать гомеостаз организма в целом [25]. Полученные нами результаты позволяют полагать, что при увеличении срока обструкции адаптационный резерв контрлатеральной почки постепенно снижается и на фоне нарастания необратимых поражений обструктивной почки может значительно повысится риск развития событий по негативному сценарию в контрлатеральной почке [26].

Заключение

Изучение фенотипа нефронов контрлатеральной почки даёт более глубокое понимание молекулярных механизмов их адаптации к увеличившейся нагрузке в динамике ОНМ. Результаты экспериментальной работы показали необходимость дальнейших молекулярно-биологических исследований с целью улучшения диагностики и лечения обструктивных уропатий.

Список литературы

1. Funahashi Y, Hattori R, Yamamoto T, Kamihira O, Moriya Y, Gotoh M. Change in contralateral renal parenchymal volume 1 week after unilateral nephrectomy. Urology. 2009;74(3):708-12. DOI: 10.1016/j.urology.2008.11.008

2. Funahashi Y, Hattori R, Yamamoto T, Aoki S, Majima T, Gotoh M. Renal parenchymal volume increases after contralateral nephrectomy: Assessment using three-dimensional ultrasonography. International Journal of Urology. 2011;18(12):857-60. DOI: 10.1111/j.1442-2042.2011.02864.x

3. Yang M, Gao F, Liu H, Pang H, Zuo YP, Yong T. Prospectively estimating the recoverability of renal function after relief of unilateral urinary obstruction by measurement of renal parenchymal volume. Acad Radiol. 2013;20(4):401-6. DOI: 10.1016/j.acra.2012.10.007

4. Евсеев С.В., Гусев А.А. Значение оценки почечной функции при почечно-клеточном раке. Вестник урологии. 2013;(3):39-53. DOI: 10.21886/2308-6424-2013-0-3-39-53

5. Li WQ, Dong ZQ, Zhou XB, Long B, Zhang LS, Yang J, Zhou XG, Zheng RP, Zhang J. Renovascular morphological changes in a rabbit model of hydronephrosis. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2014;34(4):575-81. DOI: 10.1007/s11596-014-1318-9

6. Li XD, Wu YP, Wei Y, Chen SH, Zheng QS, Cai H, Xue XY, Xu N. Predictors of Recoverability of Renal Function after Pyeloplasty in Adults with Ureteropelvic Junction Obstruction. Urol Int. 2018;100(2):209-215. DOI: 10.1159/000486425

7. Синякова Л.А., Берников Е.В., Лоран О.Б. Функциональное состояние почек у больных, перенёсших гнойный пиелонефрит. Вестник урологии. 2018;6(4):49-59. DOI: 10.21886/2308-6424-2018-6-4-49-59

8. Kramann R, Kusaba T, Humphreys BD. Who regenerates the kidney tubule? Nephrol. Dial. Transplant. 2015; 30(6):903-910. DOI: 10.1093/ndt/gfu281

9. Chevalier RL. Counterbalance in functional adaptation to ureteral obstruction during development. Pediatr Nephrol. 1990;4(4):442-4. DOI: 10.1007/BF00862533

10. Springer A, Kratochwill K, Bergmeister H, Csaicsich D, Huber J, Mayer B, Mühlberger I, Stahlschmidt J, Subramaniam R, Aufricht C. A fetal sheep model for studying compensatory mechanisms in the healthy contralateral kidney after unilateral ureteral obstruction. J Pediatr Urol. 2015;11(6):352.e1-7. DOI: 10.1016/j.jpurol.2015.04.041

11. Chevalier RL, Forbes MS, Thornhill BA. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 2009;75(11):1145-52. DOI: 10.1038/ki.2009.86

12. Choi SY, Yoo S, You D, Jeong IG, Song C, Hong B, Hong JH, Ahn H, Kim CS. Adaptive functional change of the contralateral kidney after partial nephrectomy. Am J Physiol Renal Physiol. 2017;313(2):192-8. DOI: 10.1152/ajprenal.00058.2017

13. Bianco M, Lopes JA, Beiral HV, Filho JD, Frankenfeld SP, Fortunato RS, Gattass CR, Vieyra A, Takiya CM. The contralateral kidney presents with impaired mitochondrial functions and disrupted redox homeostasis after 14 days of unilateral ureteral obstruction in mice. PLoS One. 2019;14(6). DOI: 10.1371/journal.pone.0218986

14. Cruz-Solbes A, Youker K. Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) and Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT): Role and Implications in Kidney Fibrosis. Results Probl Cell Differ. 2017;60:345-72. DOI: 10.1007/978-3-319-51436-9_13

15. He J, Xu Y, Koya D, Kanasaki K. Role of the endothelial-tomesenchymal transition in renal fibrosis of chronic kidney disease. Clin Exp Nephrol. 2013;17(4):488-97. DOI: 10.1007/s10157-013-0781-0

16. Jourde-Chiche N, Fakhouri F, Dou L, Bellien J, Burtey S, Frimat M, Jarrot P-A, Kaplanski G, Quintrec M, Pernin V, Rigothier C, Sallée M, Fremeaux-Bacchi V, Guerrot D, Roumenina L. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nat Rev Nephrol. 2019;15(2):87-108. DOI: 10.1038/s41581-018-0098-z

17. Ucero AC, Benito-Martin A, Izquierdo MC, Sanchez-Niño MD, Sanz AB, Ramos AM, Berzal S, Ruiz-Ortega M, Egido J, Ortiz A. Unilateral ureteral obstruction: beyond obstruction. Int Urol Nephrol. 2014;46: 765-76. DOI: 10.1007/s11255-013-0520-1

18. Martínez-Klimova E, Aparicio-Trejo O, Gómez-Sierra T, Jiménez-Uribe A, Bellido B, Pedraza-Chaverri J. Mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress in the promotion of fibrosis in obstructive nephropathy induced by unilateral ureteral obstruction. Biofactors. 2020;46(5):716-33. DOI: 10.1002/biof.1673

19. Giamarellos-Bourboulis EJ, Adamis T, Laoutaris G, Sabracos L, Koussoulas V, Mouktaroudi M, Perrea D, Karayannacos PE, Giamarellou H. Immunomodulatory clarithromycin treatment of experimental sepsis and acute pyelonephritis caused by multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004;48(1):93-9. DOI: 10.1128/aac.48.1.93-99.2004

20. Акименко М.А., Тодоров С.С., Колмакова Т.С. Динамика морфологических адаптационно-компенсаторных изменений в ткани контралатеральной почки при обструкции мочеточников в эксперименте. Нефрология. 2017;21(5):80-4. DOI: 10.24884/1561-6274-2017-21-5-119-124

21. Terada N, Karim MR, Izawa T, Kuwamura M, Yamate J. Immunolocalization of β-catenin, E-cadherin and N-cadherin in neonate and adult rat kidney. J Vet Med Sci. 2017;79(11):1785-90. DOI: 10.1292/jvms.17-0439

22. Prozialeck WC, Lamar PC, Appelt DM. Differential expression of E-cadherin, N-cadherin and beta-catenin in proximal and distal segments of the rat nephron. BMC Physiol. 2004;4:10. DOI: 10.1186/1472-6793-4-10

23. Djudjaj, Papasotiriou M, Bülow RD, Wagnerova A, Lindenmeyer MT, Cohen CD, Strnad P, Goumenos DS, Floege J, Boor P. Keratins are novel markers of renal epithelial cell injury. Kidney Int. 2016;89(4):792-808. DOI: 10.1016/j.kint.2015.10.015

24. Snider NT. Kidney keratins: cytoskeletal stress responders with biomarker potential. Kidney Int. 2016;89(4):738-40. DOI: 10.1016/j.kint.2015.12.040

25. Seccia T, Caroccia B, Piazza M, Rossi GP. The Key Role of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) in Hypertensive Kidney Disease. Int J Mol Sci. 2019;20(14):2-9. DOI: 10.3390/ijms20143567

26. Акименко М.А., Тодоров С.С., Колмакова Т.С. Динамика морфологических адаптационно-компенсаторных изменений в ткани почки при обструкции мочеточников в эксперименте. Нефрология. 2017;5:71-5. DOI: 10.24884/1561-6274-2017-21-5-71-75


Об авторах

М. А. Акименко
ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России
Россия

Марина Анатольевна Акименко – аспирант кафедры медицинской биологии и генетики

344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, д. 29

тел.: +7 (928) 187-79-84


Конфликт интересов:

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.



О. В. Воронова
ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России
Россия

Ольга Владимировна Воронова – ассистент кафедры судебной медицины

344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, д. 29


Конфликт интересов:

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.



Т. С. Колмакова
ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России
Россия

Татьяна Сергеевна Колмакова – докт. биол. наук, доцент; заведующая кафедрой медицинской биологии и генетики

344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, д. 29


Конфликт интересов:

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.



Для цитирования:


Акименко М.А., Воронова О.В., Колмакова Т.С. Изменения фенотипа канальцевого эпителия нефрона контрлатеральной почки при односторонней непроходимости мочеточника (экспериментальное исследование). Вестник урологии. 2021;9(3):5-11. https://doi.org/10.21886/2308-6424-2021-9-3-5-11

For citation:


Akimenko M.A., Voronova O.V., Kolmakova T.S. The changes of the tubular epithelium phenotype in the contralateral kidney nephrons while developing unilateral ureteral obstruction: an experimental study. Vestnik Urologii. 2021;9(3):5-11. (In Russ.) https://doi.org/10.21886/2308-6424-2021-9-3-5-11

Просмотров: 56


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2308-6424 (Online)