Широкое распространение заболеваний почек, вызванных обструкцией мочевых путей, привело к необходимости экспериментальных и клинических исследований механизмов и закономерностей развития компенсаторных процессов при их поражении [1][2][3][4][5][6][7]. Почка является узкоспециализированным, сложным органом и обладает способностью восстанавливать свою функциональность после некоторой степени повреждения [8]. Существует понятие почечного противовеса, который представляет собой феномен повышенной функциональной нагрузки на первоначально неповреждённую почку пропорционально снижению функции, повреждённой в результате односторонней непроходимости мочеточника (ОНМ) [9][10]. Однако, морфологические и функциональные изменения в контрлатеральной почке изучены недостаточно. Между тем данные литературы позволяют полагать, что изменения в неповреждённой почке отражают адаптации органа не только к возросшей нагрузке, но и направлены на поддержание гомеостаза организма в целом на фоне развивающегося окислительного стресса и митохондриальной дисфункции вследствие ОНМ [11][12][13].

Механизмы, лежащие в основе адаптационной способности почек, все ещё остаются предметом дискуссий и в качестве одного из таких механизмов рассматривается эпителиальномезенхимальный переход (ЭМП). В процессе ЭМП происходит изменение формы, потеря полярности, повышение подвижности эпителиальных клеток, связанные с увеличением производства в них коллагена, и образуются высокоинвазивные, мигрирующие, веретенообразные, удлинённые мезенхимные клетки [14]. Изменения полярности и морфологии клеток сопровождаются снижением экспрессии маркеров эпителиального фенотипа и появлением мезенхимальных маркеров [15][16]. Утрата признаков тканевой дифференцировки клеток, несомненно, отражается на функции органа в целом.

Следовательно, поиск ключевых процессов, приводящих к необратимому повреждению обструктивной почки, а также процессов, обеспечивающих выполнение компенсаторных функций контрлатеральной почкой, является важной задачей для более точной диагностики, лечения и прогноза обструктивных заболеваний почек. Использование экспериментальной модели даёт возможность проследить последовательность изменений как в поражённой, так и в контрлатеральной почке в динамике обструкции [17][18].

Цель исследования – изучить изменения фенотипа эпителиальных клеток нефрона контрлатеральной почки при ОНМ на экспериментальной модели.

Экспериментальная модель ОНМ воспроизводилась на взрослых кроликах самцах в возрасте 3,5 месяцев, весом 2,4 – 2,75 кг по методике E. Giamarellors-Bourbalis et al. [19]. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей, Федерацией европейских ассоциаций по науке о лабораторных животных и Международным советом по науке о лабораторных животных. Исследования были разрешены локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО РостГМУ (протокол №21/15 от 10.12.2015 года). В зависимости от срока эксперимента кроликов разделили на 4 группы по 6 животных в каждой: первая группа – контрольная, вторая группа – 7 суток обструкции мочеточника, третья группа – 14 суток и четвёртая – 21 сутки механической обструкции левого мочеточника.

Для морфологических исследований образцы ткани контрлатеральных почек фиксировали 10% забуференным нейтральным формалином с дальнейшей гистологической проводкой, заключением в парафиновые блоки и микротомией. Серийные срезы тканевых образцов окрашивали гематоксилином и эозином по классическому протоколу для дальнейшей микроскопии и анализа морфологических изменений. Для оценки морфометрических показателей контрлатеральных почек готовые гистологические препараты сканировали на сканере гистопрепаратов (Aperio CS2 Leica, Germany) с увеличением в 40 раз. На полученных изображениях в программе Aperio ImageScope (v. 12.4.0) при помощи встроенных инструментов и шкалы измеряли структуры нефрона.

Иммунофенотипирование образцов ткани контрлатеральной почки проводили на маркеры эпителиального и мезенхимального фенотипов с использованием первичных моноклональных мышиных антител. В качестве маркеров эпителиального фенотипа использовали Anti-Cytoceratin 7 (СК7) (Abcam 9021, USA, разведение 1:200) и Anti-Е-cadgerin (Abcam 233766, USA, разведение 1:150). Признаки мезенхимального фенотипа определяли с использованием Vimentin antibody (Vim) (Biorbyt 317381, UK, разведение 1:200) и Smooth Muscle Actin antibody (α-SMA) (Biorbyt 334169, UK, разведение 1:250). Визуализацию образовавшихся комплексов антиген-антитело проводили на системе детекции EnVision FLEX (Dako, Дания).

Микроскопию и фотосьёмку образцов осуществляли на автоматической системе со светодиодной подсветкой Leica DM4000 B LED (Германия). Результаты ИГХ-реакций оценивали по интенсивности окрашивания каждого из маркеров.

К 7-м суткам эксперимента зарегистрировано незначительное уменьшение мочевого пространства в почечном тельце нефрона за счёт увеличения площади сосудистого клубочка. Через две недели развития ОНМ в компенсаторной почке определены дистрофические изменения канальцевого аппарата в виде гиалиново-капельной и гидропической дистрофии. В клубочках отмечено увеличение площади и диаметра почечного тельца в сравнении с контролем и незначительное уменьшение просвета проксимального канальца за счёт увеличения высоты эпителия. На 21-е сутки ОНМ выявлены изменения в строме почечной ткани в форме сетчатого фиброза, локализующегося между отдельными канальцевыми структурами мозгового вещества почки. Морфометрически показано, что на фоне изменений в клубочковой зоне и проксимальных канальцах появляются изменения в дистальных канальцах в виде увеличения высоты эпителия.

Иммунофенотипирование контрлатеральной почки показало, что экспрессия эпителиальных маркеров (Е-кадгерин и СК7) на протяжении всего эксперимента поддерживалась на уровне, сопоставимом со здоровой почкой. В динамике эксперимента Е-кадгерин определялся в канальцевых сегментах нефрона контрлатеральной почки как в проксимальных, так и дистальных канальцах (рис. 1 А). Визуализацию СК7-позитивных клеток регистрировали как в эпителии канальцевых сегментов нефрона, так и в эпителии собирательных трубочек на всех сроках эксперимента (рис. 1 В).

На всех сроках ОНМ количество α-SMA позитивных клеток соответствовало контролю (рис. 2 А). Однако, к 21-м суткам эксперимента была зафиксирована визуализации виментина не только в почечном тельце, что является нормой, но и диффузно в проксимальных канальцах нефрона контрлатеральной почки (рис. 2 В). Таким образом, к 21-м суткам ОНМ на фоне адекватной экспрессии эпителиальных маркеров регистрировалось появление маркера мезенхимального фенотипа, что свидетельствует о реакции эпителия нефрона на увеличение нагрузки.

Следовательно, диффузная визуализация мезенхимального маркера виментина в эпителии канальцевой части нефрона контрлатеральной почки на 21-е сутки ОНМ синхронизируется с зарегистрированными морфометрическими и гистологическими изменениями в виде гидропической и гиалиново-капельной дистрофии в этих же структурах.

Увеличение функциональной нагрузки на контрлатеральную почку вследствие ОНМ является фактором стресса для эпителиальных клеток почечных канальцев. Проведённое нами иммуногистохимическое исследование выявило молекулярно-биологические изменения в эпителии нефрона. Эти результаты взаимосвязаны с ранее полученными показателями морфологического исследования контрлатеральной почки в динамике ОНМ [20]. В частности, в течение двух недель эксперимента не зарегистрировано изменений иммунофенотипа эпителия нефрона контрлатеральной почки, в свою очередь морфологические изменения носят адаптивный характер, не выходя за рамки физиологической нормы с учётом увеличения нагрузки на компенсаторный орган. Данные иммуногистохимического исследования эпителиального фенотипа, а именно визуализация СK7 и чёткая экспрессия E-кадгерина в эпителии канальцев нефрона на протяжении всех сроков эксперимента, подтверждают сохранение структурной целостности эпителиоцитов и межклеточной адгезии эпителиального пласта канальцевых структур, а следовательно, и поддержание эффективности, выполняемой ими функции. Основанием для этого вывода служат данные о важной роли мембранного белка E-кадгерина в сохранении целостности и полярности почечного эпителия, а также в поддержании межклеточной адгезии во всех отделах нефрона [21][22]. В свою очередь эпителиальные кератины служат чувствительными индикаторами стресса, они обеспечивают структурную и механическую целостность эпителиоцитов, однако снижение их экспрессии увеличивает восприимчивость эпителия к повреждению, а их потеря считается характерным признаком ЭМП [23][24]. Визуализация в компенсаторной почке двух высокоспецифичных эпителиальных маркеров позволяет говорить о сохранности эпителия нефрона в течение всего периода эксперимента и успешной физиологической адаптации органа к возросшей нагрузке.

Появление маркера мезенхимального фенотипа виментина к 21-м суткам ОНМ можно расценивать как начальный этап процесса перестройки цитоскелета эпителиальных клеток канальцев нефрона в ответ на увеличение нагрузки. Существует мнение, что даже незначительные изменения фенотипа эпителиальных клеток указывают на формирование процессов адаптации нефрона к сверхнагрузке, в том числе и через ЭМП. По утверждению T. Seccia et al. экспрессия мезенхимальных белков в эпителии нефрона отражает стресс-устойчивость почки в условиях повышенной нагрузки и её способность продолжать поддерживать гомеостаз организма в целом [25]. Полученные нами результаты позволяют полагать, что при увеличении срока обструкции адаптационный резерв контрлатеральной почки постепенно снижается и на фоне нарастания необратимых поражений обструктивной почки может значительно повысится риск развития событий по негативному сценарию в контрлатеральной почке [26].

Изучение фенотипа нефронов контрлатеральной почки даёт более глубокое понимание молекулярных механизмов их адаптации к увеличившейся нагрузке в динамике ОНМ. Результаты экспериментальной работы показали необходимость дальнейших молекулярно-биологических исследований с целью улучшения диагностики и лечения обструктивных уропатий.