Опухоль-ассоциированные фибробласты и клинико-морфологические особенности течения рака простаты

Введение

Рак предстательной железы (РПЖ) постепенно занимает лидирующую позицию в структуре распространённости злокачественных новообразований у мужчин во всём мире. Так, в 2022 году число впервые выявленных случаев РПЖ превысило 1,4 миллиона, составляя 14,2% от всех выявленных опухолей, уступая только раку лёгких [1]. С каждым годом эта тенденция нарастает, и к 2040 году прогнозируется увеличение выявления новых случаев в два раза – до 2,9 миллиона [2].

Основным рекомендуемым методом лечения РПЖ является радикальная простатэктомия, однако для пациентов низкого онкологического риска с ожидаемой продолжительностью жизни более 10 лет целесообразной является тактика активного наблюдения [3][4], позволяющая сохранить качество жизни пациентов, которое на фоне функциональных последствий радикальной простатэктомии в виде недержания мочи и эректильной дисфункции резко снижается [5]. Распространённость активного наблюдения за пациентами с РПЖ низкого риска прогрессии в странах Европы достигает 95%, причём отмечается, что данная опция может быть предложена и пациентам из группы промежуточного онкологического риска без повышения риска прогрессии. Через 10 лет активного наблюдения до 20% мужчин с РПЖ низкого и 30% промежуточного онкологических рисков требуют выполнения оперативного лечения, что, помимо функциональных преимуществ для пациентов, помогает существенно снизить экономические затраты на систему здравоохранения [6].

Для оценки показаний к активному наблюдению, перехода от активного наблюдения к лечению, а также отслеживания биохимического рецидива используются различные клинико-морфологические маркёры, среди которых стадия заболевания, уровень простат-специфического антигена (ПСА), изменения, выявляемые при магнитно-резонансной томографии (МРТ) органов малого таза, градация опухоли по Gleason [3][4]. В последние годы исследователи уделяют особое внимание структуре опухолевого микроокружения, которое, как предполагается, может модулировать поведение опухолевых клеток за счёт различных паракринных факторов и таким образом выступать в качестве маркёра характера течения и прогноза РПЖ [7][8].

Одним из компонентов опухолевого микроокружения являются опухоль-ассоциированные фибробласты (CAFs). Предполагается, что CAFs стимулируют инвазию опухолевых клеток за счёт продукции компонентов внеклеточного матрикса, ангиогенез и секрецию ряда цитокинов, хемокинов и факторов роста, приводящих к нарушению локальной иммунной регуляции [9]. Накапливаются данные о том, что CAFs играют важную роль в патогенезе различных опухолей, в том числе РПЖ. Они напрямую связаны с метастазированием, прогрессированием и, следовательно, неблагоприятным прогнозом РПЖ [10].

Выявление CAFs в структуре опухолевого микроокружения осуществляется за счёт оценки сразу нескольких специфических маркёров, таких как белок активации фибробластов (FAP), α-гладкомышечный актин (α-SMA), фибробласт-специфический протеин 1, десмин, CD90, рецепторы тромбоцитарного фактора роста α и β (PDGFR α и β) и некоторые другие, каждый из которых несёт ряд необходимых для поддержания опухоли функций [11]. Различные субпопуляции CAFs могут экспрессировать различные комбинации маркёров, что затрудняет детекцию и часто требует одновременной оценки нескольких из них.

Наиболее распространённым маркёром CAFs, встречающимся в 90% опухолей, является FAP. В норме FAP отвечает за ремоделирование внеклеточного матрикса за счёт эндопептидазной активности, обеспечивающей расщепление коллагена, участвуя тем самым в заживлении ран [12]. В случае повышенной экспрессии FAP при опухолевом процессе ремоделирование внеклеточного матрикса может приводить к повышенному инвазивному потенциалу и, как следствие, более неблагоприятному прогнозу заболевания [13].

В физиологических условиях ещё один из маркёров CAFs PDGFR также играет ключевую роль в ремоделировании тканей, рубцевании и фиброзе, стимулирует пролиферацию и миграцию фибробластов с дальнейшим синтезом коллагена [14]. PDGFR существует в виде двух изоформ (α и β), каждая из которых представляет собой рецепторную тирозинкиназу. При онкологическом процессе активация PDGFRα + β ведёт к усиленной секреции коллагена и компонентов внеклеточного матрикса, стимулируя формирование опухолевой стромы [15].

Взаимосвязь маркёров CAFs, FAP и PDGFRα + β с клинико-морфологическими особенностями и течением заболевания широко представлена для рака молочной железы [16][17] и рака яичников [18], где показана чёткая ассоциация с неблагоприятными прогностическими характеристиками и исходами. При этом аналогичные данные для простаты находятся на стадии активного изучения и на сегодняшний день крайне ограничены.

В связи с этим целью настоящего исследования стала оценка взаимосвязи клинико-морфологических особенностей РПЖ и маркёров CAFs, FAP и PDGFRα + β.

Материалы и методы

Дизайн исследования. В рамках исследования были изучены образцы ткани простаты, полученные от 34 пациентов с РПЖ. Возраст пациентов варьировался от 52 до 77 лет (средний возраст — 64,1 года). Была собрана информация об уровне ПСА крови до операции, объёме предстательной железы, наличии очагового поражения простаты по результатам МРТ органов малого таза, вероятности поражения лимфатических узлов, оценённой по номограмме MSKCC. Также определены морфологические характеристики РПЖ: градация опухоли по Gleason, наличие лимфоваскулярной и периневральной инвазии, патологическая стадия по TNM. В соответствии с комбинацией данных показателей оценивали градацию РПЖ по системе ISUP.

Операционный материал был окрашен на маркёры CAFs — FAP и PDGFRα + β. В дальнейшем проводили анализ взаимосвязи данных маркёров и клинико-морфологических особенностей течения РПЖ.

Иммуногистохимическое исследование. Иммуногистохимическое исследование проводили в автоматическом режиме в автостейнере BOND-III (“Leica Biosystems”, Hussloch, Germany) с двумя антителами: кроличьими моноклональными (Y92) PDGFR alpha + PDGFR beta (ab32570) и кроличьими моноклональными (EPR20021) FAP (ab207178) (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle upon Tyne, UK). Депарафинирование осуществляли с помощью Bond Dewax Solution (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle upon Tyne, UK), демаскировку антигенов — при помощи раствора для высокотемпературной демаскировки Bond Epitope Retrieval-2 (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle upon Tyne, UK). В качестве системы детекции использовали Bond Polymer Refine Detection (Leica Biosystems Newcastle Ltd, Newcastle upon Tyne, UK)

Экспрессию PDGFRα + β определяли вокруг опухолевых комплексов. Оценивали интенсивность реакции в заявленной зоне от 0 до 3 баллов (0 — отсутствует, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — выраженная). FAP оценивали по той же шкале.

Статистический анализ. Статистический анализ данных был выполнен с использованием программного обеспечения RStudio на языке программирования R. Нормальность распределения проверяли с помощью теста Shapiro-Wilk. Количественные переменные были представлены в виде медианы и межквартильного интервала [Q1; Q3]. Номинальные переменные были представлены в виде абсолютных значений (n) и частотных характеристик (%). Сравнительный анализ количественных переменных в двух независимых выборках проводили с использованием критерия Mann-Whitney U test. Сравнительный анализ номинальных переменных в двух независимых выборках осуществляли с использованием критериев Хи-квадрата Pearson, Хи-квадрата Pearson с поправкой Yates, точного критерия Fisher. Корреляционный анализ выполняли с использованием коэффициента ранговой корреляции Spearman. В каждом анализе различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

В ходе сравнительного анализа клинико-лабораторных и морфологических показателей пациентов с наличием и отсутствием FAP в составе опухолевого микроокружения РПЖ было установлено, что для пациентов с наличием FAP были характерны более агрессивные характеристики опухоли, ассоциированные с более неблагоприятным прогнозом заболевания (табл. 1, рис. 1). Так, при наличии FAP отмечалась более высокая градация опухоли по Gleason: в 81,3% случаев РПЖ классифицировался как 4 + 3= 7 и выше, в то время как при отсутствии FAP только 33,3% опухолей относилось к данной категории (р = 0,014). Аналогичная закономерность была характерна и для градации опухоли по классификации ISUP, однако различия по ISUP обладали пограничным уровнем значимости (р = 0,066). Помимо этого, для пациентов с наличием FAP значительно чаще была характерна лимфатическая инвазия (L), определённая в 43,8% случаев, в то время как при отсутствии FAP — только в 5,6% (р = 0,015).

При наличии FAP у пациентов чаще отмечали поражение лимфатических узлов. Так, рN1 выявлялось в 31,2% случаев у пациентов с наличием FAP и только у 5,6% пациентов с отсутствием FAP, однако выявленная закономерность отличалась пограничным уровнем значимости (р = 0,078). Дополнительно было отмечено, что у 100% пациентов с наличием FAP визуализировалось очаговое поражение простаты по результатам МРТ органов малого таза с внутривенным контрастированием, в то время как у пациентов с отсутствием FAP частота очагового поражения составила 66,7% (р = 0,044).

В ходе сравнительного анализа клинико-лабораторных и морфологических показателей пациентов в зависимости от экспрессии PDGFRα + β в составе TME РПЖ было установлено, что для пациентов с умеренной / выраженной экспрессией PDGFRα + β были характерны более агрессивные характеристики опухоли, ассоциированные с более неблагоприятным прогнозом заболевания по сравнению с пациентами с отсутствием / слабой экспрессией PDGFRα + β (табл. 2, рис. 2). Так, при умеренной / выраженной экспрессии PDGFRα + β отмечалась более высокая градация опухоли по Gleason: в 80,0% случаев РПЖ классифицировался как 4 + 3 = 7 и выше, в то время как при отсутствии / слабой экспрессии PDGFRα + β только 36,8% опухолей относилось к данной категории (р = 0,030). Аналогичная закономерность была характерна и для градации опухоли по классификации ISUP (р = 0,015).

Очаговое поражение простаты по результатам МРТ также чаще встречалось у пациентов с умеренной / выраженной экспрессией PDGFRα + β (100% и 70,6% соответственно), однако, несмотря на явную связь, различия отличались пограничным уровнем значимости (р = 0,063). Помимо этого, пациенты с умеренной / выраженной экспрессией PDGFRα + β имели более высокую вероятность вовлечения лимфатических узлов, оценённую по номограмме MSKCC (26,0% для пациентов с умеренной / выраженной экспрессией PDGFRα + β и 10,0% для пациентов с отсутствием / слабой экспрессией PDGFRα + β), однако различия также оказались статистически незначимыми (р = 0,097).

Взаимосвязь между выраженностью экспрессии FAP и PDGFRα + β в структуре TME РПЖ и количественными клинико-лабораторными и морфологическими параметрами пациентов с РПЖ была оценена также при помощи корреляционного анализа, результаты которого представлены в виде тепловой матрицы корреляций на рисунке 3, где отчётливо видно, что как FAP, так и PDGFRα + β отличаются наличием умеренной положительной взаимосвязи с такими факторами, как градация опухоли по Gleason, вероятность поражения лимфатических узлов по MSKCC. При повышении экспрессии FAP и PDGFRα + β отмечается повышение градации опухоли по Gleason (r = 0,47 и r = 0,38 соответственно) и повышение вероятности поражения лимфатических узлов, оценённой при помощи номограммы MSKCC (r = 0,45 и r = 0,36 соответственно), что ещё раз подтверждает взаимосвязь изучаемых маркёров CAFs с факторами более агрессивного течения РПЖ.

Обсуждение

CAFs являются ключевым компонентом опухолевого микроокружения, тесно связанного с клинико-морфологическими особенностями опухолей. Так, было установлено, что CAFs в строме рака яичников ассоциированы с более распространённым процессом, метастатическим поражением лимфатических узлов и сальника [19][20]. Аналогичные результаты были показаны для назофарингеальной карциномы, рака молочной железы [21], холангиокарциномы [22], колоректального рака [23]. В настоящем исследовании была показана взаимосвязь клинико-морфологических особенностей РПЖ и маркёров CAFs, FAP и PDGFRα + β. Было показано, что FAP и PDGFRα + β ассоциированы с более неблагоприятным профилем клинико-морфологических особенностей РПЖ, в частности с большим уровнем ПСА до операции, большей вероятностью поражения лимфатических узлов, более высокой градацией опухоли по Gleason. Полученные результаты подтверждают, что наличие и более высокая экспрессия маркёров CAFs могут быть ассоциированы с более агрессивными морфологическими проявлениями РПЖ.

Похожие результаты были получены в рамках исследования китайских коллег Zh. Wu et al. (2021), где детекция CAFs осуществлялась с использованием маркёров FAP и α-гладкомышечного актина (α-SMA). Исследователями было показано, что экспрессия данных маркёров отмечается в стромальных фибробластах и отсутствует в опухолевых клетках. Дополнительно было установлено, что FAP и α-SMA статистически значимо чаще встречаются в опухолевой строме по сравнению со стромой нормальной предстательной железы. При оценке взаимосвязи экспрессии FAP с клинико-морфологическими особенностями РПЖ исследователи показали, что при наличии FAP стадия сТ3 и выше встречалась у 61,1% пациентов, в то время как при отсутствии FAP — только у 42,1% (р = 0,003) [24]. В настоящем исследовании наблюдалась аналогичная взаимосвязь: при наличии FAP cT3 стадия выявлялась у 68,8% пациентов, в то время как при отсутствии — у 38,9%, однако, несмотря на явную тенденцию большей распространённости процесса у пациентов с экспрессией FAP, различия были статистически незначимыми, что может быть связано с небольшим объёмом выборки пациентов.

В рамках дальнейшего анализа Zh. Wu et al. (2021) установили чёткую взаимосвязь FAP с градацией опухоли по Gleason. При наличии FAP у 87,0% пациентов сумма баллов по Gleason была 7 и выше, в то время как при отсутствии FAP — у 71,1% (р = 0,031) [24]. В нашем исследовании была отмечена подобная закономерность. Так, у пациентов с наличием FAP чаще встречался РПЖ с более высокой градацией по Gleason, что подтверждалось также в рамках корреляционного анализа. Zh. Wu et al. (2021) также выявили, что у пациентов с наличием экспрессии FAP чаще выявлялось метастатическое поражение лимфатических узлов (16,6% и 2,6% соответственно, р = 0,012), а также имело место более высокое значение ПСА на момент постановки диагноза по сравнению с пациентами с отсутствием экспрессии FAP [24]. Похожие данные были получены и нами. Так, метастазы в лимфатических узлах у пациентов с экспрессией FAP и без неё определялись в 31,2% и 5,6% случаев соответственно (р = 0,078). Общий ПСА на момент постановки диагноза при наличии FAP по медиане также был больше, чем при отсутствии FAP (10,9 нг/мл и 6,7 нг/мл), однако различия также оказались статистически незначимыми.

Дополнительно нами было показано, что ещё один маркёр CAFs, PDGFRα + β также взаимосвязан с неблагоприятными клинико-морфологическими особенностями РПЖ, в частности с градацией опухоли по Gleason. Похожие данные были получены в работе W. Ageeli et al. (2022), где исследователи оценили взаимосвязь маркёров CAFs с градацией опухоли по Gleason и жёсткостью ткани простаты по результатам ультразвукового исследования (УЗИ). В ходе работы было показано, что с повышением УЗ-жёсткости ткани простаты повышается экспрессия PDGFRα и β: коэффициенты корреляции Spearman составили 0,912 и 0,925 соответственно. Аналогичные данные были получены при сопоставлении экспрессии данных маркёров с градацией опухоли по Gleason. Так, при РПЖ 3 + 3 по Gleason экспрессия PDGFRα и β составила 0,5% и 1,4% соответственно, в то время как при РПЖ 4 + 3 возрастала до 14,3% и 11,3% соответственно с дальнейшим прогрессивным увеличением [25]. В рамках настоящей работы мы показали, что у пациентов с умеренной/выраженной экспрессией PDGFRα + β в 100% случаев присутствует очаговое поражение предстательной железы по результатам МРТ, в то время как при отсутствии/слабой экспрессии — только в 70,6% (р = 0,063). Помимо этого, у пациентов с умеренной/выраженной экспрессией PDGFRα + β в 80% случаев отмечается РПЖ 4 + 3 = 7 и выше по Gleason, в то время как аналогичный показатель у пациентов с отсутствием/слабой экспрессией составляет 36,8% (р = 0,030). Несколько другие данные были получены A.B. Hesterberg et al. (2021). Было показано, что с увеличением градации РПЖ по Gleason экспрессия PDGFRβ постепенно увеличивается, однако данное увеличение было статистически незначимым, что может быть связано с маленьким объёмом включённых в анализ пациентов (21 пациент после радикальной простатэктомии) [26].

Похожие результаты, показывающие неблагоприятный эффект CAFs на клинико-морфологические особенности РПЖ, были получены в работе J. Linxweiler et al. (2020) на животной модели, где на фоне прививки мышей опухолевыми клетками с CAFs замечено более высокое повышение уровня ПСА, а также более частое метастатическое поражение лимфатических узлов и лёгких по сравнению с особями, привитыми только опухолевыми клетками или опухолевыми клетками с неопухоль-ассоциированными фибробластами [27]. T. Shen et al. (2022) показали, что совместное культивирование CAFs c опухолевыми клетками РПЖ приводит к повышению периневральной инвазии [28].

Возможным механизмом, опосредующим неблагоприятные клинико-морфологические особенности РПЖ при повышенной экспрессии маркёров CAFs, может быть усиленная пролиферация и миграция опухолевых клеток под воздействием выделяемых CAFs цитокинов. Это было подтверждено в работе D-Y. Sun et al. (2019) как в условиях in vitro, так и in vivo [29]. В качестве ключевого цитокина выступал TGF-β1, концентрация которого в кондициональной среде опухолевых клеток с CAFs была значительно выше, чем в среде изолированных опухолевых клеток. Отмечалось, что ингибитор рецептора TGF-β1 мог подавлять индуцированную CAFs клеточную пролиферацию и миграцию опухолевых клеток РПЖ [29]. Помимо этого, CAFs могут секретировать ряд других медиаторов, опосредующих иммуносупрессию: PD-1 и его лиганд PD-L1, фактор роста эндотелия VEGF, интерлейкины 6, 8, 23 [30]. Показано, что CAFs способны увеличивать экспрессию ряда транскрипционных факторов и путей, участвующих в клеточной пролиферации РПЖ, усиливая тем самым инвазивный потенциал, среди которых описаны YAP1 [28], сигнальный путь Eph/Ephrin [31], сигнальный путь Notch [32], MAPK и многие другие [33][34].

Основным ограничением настоящего исследования является небольшое количество включённых в анализ пациентов, однако на следующем этапе мы планируем устранить данный недостаток и расширить объём выборки, а также, помимо клинико-морфологических особенностей, проанализировать исходы РПЖ с учётом опухолевого микроокружения.

Заключение

Полученные в настоящем исследовании результаты показали, что наличие и выраженность экспрессии маркёров стромальных CAFs ассоциированы с неблагоприятными клинико-морфологическими особенностями РПЖ, в частности с более высокой градацией опухоли по Gleason, более частым наличием очагов в предстательной железе по результатам МРТ органов малого таза, наличием инвазии в лимфатические сосуды. Полученные данные могут указывать на неблагоприятную роль CAFs в развитии и прогрессии РПЖ, которые сами по себе могут использоваться в качестве прогностических биомаркёров как у пациентов, находящихся под активным наблюдением, так и у пациентов, перенёсших радикальную простатэктомию. У первых появление или усиление экспрессии CAFs может рассматриваться как возможный сигнал для перехода от активного наблюдения к лечению, в то время как у вторых — как знак более настороженного динамического послеоперационного контроля. Для однозначного подтверждения данных выводов необходимо расширение объёма выборки пациентов, а также анализ отдалённых результатов и исходов РПЖ в зависимости от наличия и выраженности CAFs.