Динамическая оценка гистоморфологических и функциональных изменений в почках экспериментальных животных при ударно-волновом воздействии

Введение

Мочекаменная болезнь (МКБ), или уролитиаз, — широко распространённое во всём мире заболевание. Ежегодная заболеваемость уролитиазом в мире составляет 0,5 – 5,5%, а в некоторых странах и эндемичных по МКБ районах — до 13 – 20% [1 – 4]. В структуре общей урологической патологии МКБ занимает второе место после инфекции мочевых путей [5]. На долю больных МКБ приходится от 30 до 50% всего контингента урологических стационаров [6]. Абсолютное число зарегистрированных пациентов с МКБ в РФ в 2012 году составило 787 555 человек, а показатель числа зарегистрированных больных на 100 000 всего населения был равен 550,5. По сравнению с 2002 годом прирост абсолютного числа пациентов с МКБ составил + 25,1% [7]. В связи с длительными сроками реабилитации пациентов и потерей трудоспособности МКБ представляет собой актуальную медицинскую и социальную проблему.

За последние несколько десятков лет достигнуты значительные успехи в дезинтеграции конкрементов за счёт применения неинвазивных и малоинвазивных методик. Дистанционная ударно-волновая литотрипсия (ДУВЛ) как монотерапия используется для лечения камней в почках с 80-х годов прошлого столетия, несмотря на активное внедрение в клиническую практику методов ретроградной интраренальной хирургии и перкутанной нефролитотрипсии [8 – 10].

ДУВЛ, являющаяся альтернативным подходом в хирургии уролитиаза, как любая операция, не лишена осложнений. Ударная волна при любом типе применяемого аппаратного воздействия неизбежно приводит к повреждению почки [11 – 13].

Проблема сопутствующего повреждения почечной паренхимы при проведении ДУВЛ камней почек до сих пор остаётся актуальной и нерешённой.

Отсутствие единой концепции механизма повреждения почечной паренхимы при проведении ДУВЛ камней почек, недооценка осложнений, неясность в периодичности этапов лечения, недостаток биомаркёров, ориентированных на раннюю диагностику повреждения почки, объясняют сохраняющуюся актуальность продолжающихся исследований.

Цель исследования: уточнить механизмы повреждения и защиты почки при ударно-волновом воздействии с динамической оценкой гистоморфологических и функциональных изменений у экспериментальных животных.

Материалы и методы

Дизайн исследования: рандомизированное, одномоментное, проспективное, когортное исследование, метод — случай-контроль. Исследование проведено на 50 половозрелых нелинейных белых крысах, самцах весом 240 – 290 г. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с рекомендациями FELASA и соответствующими национальными законами (Российская Федерация, №498-ФЗ 27.12.2018) о защите и гуманном обращении с животными. Протокол исследования был одобрен локальным независимым этическим комитетом Ул ГУ ИМЭ и ФК №12 от 01.12.2022.

Животные были рандомизированы в две группы: группа 1 — интактные животные (группа сравнения — n = 10), группа 2 (n = 40) — животные, которым проводили однократно дистанционное ударно-волновое воздействие (ДУВВ).

Животных наркотизировали введением тиопентала натрия (50 мг/кг внутрибрюшинно). После наступления наркотического сна у животного тщательно выбривали место входа ударной волны в проекции левой почки на спине, смазывали тонким слоем вазелина, крысу фиксировали на специальном ложементе, под ультразвуковым контролем левую почку совмещали с фокусом ударной волны. ДУВВ проводили в соответствии с рекомендуемыми параметрами для лабораторных животных: амплитуда давления — от 300 до 1000 атм., длительность импульса — менее 0,8 мкс, величина энергии — от 3,5 до 7,8 Дж, напряжение генератора — 0,5 кВ, количество импульсов — 1000. Процедуру выполняли однократно на литотрипторе Lithostar-plus («Siemens Healthineers AG», Erlangen, Germany) с электромагнитной генерацией ударных волн, продолжительность сеанса составляла 7 минут.

В дальнейшем под общим наркозом осуществляли эвтаназию животных путём декапитации на 1-е (n = 10), 3-и (n = 10), 7-е (n = 10), 14-е (n = 10) сутки после ДУВВ. Для исследования производили забор крови путём пункции сердца, левую почку использовали для приготовления гомогената.

Для приготовления общей цитоплазматической фракции почку растирали в гомогенезаторе Potter с буфером, содержащим 0,1 М раствор KCI, 1 мМ раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты, 20 мМ раствор Трис-HCI (pH = 7,0), далее экстракт центрифугировали при 10000 g, супернатант разливали по пластиковым пробиркам V = 0,2 мл и хранили до использования при t = – 200 ºC.

У подопытных животных, которых подвергали ДУВВ, в гомогенате почек были изучены маркёры свободнорадикального окисления: (белковые карбонильные группы (БКГ), малоновый диальдегид (МДА), отражающие степень повреждения канальцевого эпителия почки. Также в почечном гомогенате исследовали содержание ферментов, отражающих степень антиоксидантной защиты (АОЗ) почки, такие как супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГПО), глутатион восстановленный (GSH), глутатионредуктаза (ГР).

Для гистоморфологической оценки в почках забор материала производили на 1-е (n = 10), 3-и (n = 10), 7-е (n = 10), 14-е (n =  10) сутки после ДУВВ. Изъятый материал подвергали светооптическому и микроскопическому исследованию. Микроскопию проводили в проходящем свете с помощью бинокулярного микроскопа AxioStar Plus ("Carl Zeiss AG", Oberkochen, Germany). Материал окрашивали с помощью общепринятых методик гематоксилином и эозином, пикрофуксином по van Gieson. При морфологическом исследовании основное внимание обращали на варианты проявления альтеративных изменений, которые отражали выраженность повреждающего действия сфокусированных ударных волн. В качестве альтеративных изменений мы оценивали различные виды дистрофии, проявления некроза и некробиоза, а также сосудистые нарушения в виде полнокровия сосудов микроциркуляторного русла, отёка и кровоизлияний. С позиций обратимости и необратимости патологических изменений в почке после ДУВВ мы оценивали степень воздействия сфокусированных ударных волн в динамике.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета Statistica v.10.0 ("StatSoft Inc.", Tulsa, OK, USA). Нормальность распределения проверяли с помощью теста Shapiro-Wilk. Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). Достоверность различий между показателями оценивали t-критерием Fisher-Student. При значении р < 0,05 различия считали статистически достоверными.

Результаты

Маркёры свободнорадикального окисления в гомогенате ткани почки экспериментальных животных после ДУВВ в динамике представлены в таблице 1.

Оценивая показатели в гомогенате ткани почки экспериментального животного, мы выявили статистически значимое увеличение белковых карбонильных групп в 1‑й день после ДУВВ в сравнении с группой 1 (p₁ < 0,001). С течением времени, на 3-и и 7-е сутки, уровень белковых карбонильных групп снижался, а к 14-м суткам приходил к значениям, достоверно не отличающимися от таковых в группе 1 (p₄ > 0,05).

Возвращение уровня карбонильных групп к базовым значениям может свидетельствовать о завершении синдрома ишемии — реперфузии после ДУВВ.

Иным образом обстоит ситуация с динамикой концентрации малонового диальдегида в гомогенате почки. Анализ уровня концентрации малонового диальдегида в гомогенате почки показал его увеличение в 3,6 раза в первый день, в 3,3 раза — в 3-й, в 2,6 раза — на 7‑й день, в 1,9 — на 14-е сутки, так и не вернувшегося к базовым значениям (р₄ > 0,05). Примечательно, что в каждой контрольной точке (3-и, 7-е, 14-е сутки) был отмечен уровень малонового диальдегида, который был достоверно ниже предыдущего.

В таблице 2 представлены антиоксидантные ферменты в гомогенате почки экспериментальных животных после ДУВВ в разные временные периоды.

Отмечается статистически значимое снижение активности фермента супероксиддисмутазы в 1‑й день после ДУВВ (р₁ < 0,001), в последующем, на 3-и и 7-е сутки, наблюдалось некоторое повышение активности СОД. К 14-м суткам уровень становится ещё выше, однако он не достигает базовых значений. Аналогичный тренд прослеживается при анализе активности глутатионредуктазы.

Несколько иные закономерности обнаружены при изучении динамики глутатионпероксидазы. После статистически значимого снижения следует рост активности, к 14-м суткам уровень этого фермента достигает исходных значений.

Динамика уровня восстановленного глутатиона в почечном гомогенате в целом повторяет динамику антиоксидантных ферментов: в первые сутки отмечено достоверное снижение, а в последующих контрольных точках фиксировался его рост. Тем не менее к 14-му дню уровень восстановленного глутатиона не достигает исходного.

Следующим этапом нашего исследования была гистоморфологическая оценка изменений в почках под воздействием ДУВВ.

Макроскопически левая почка увеличена в размерах по сравнению с правой, собственная фиброзная капсула почки из-за выраженного отёка истончена, натянута в области верхнего полюса, о чём свидетельствует лоснящаяся поверхность почки. В то же время в области тела и нижнего полюса почки капсула растянута, собирается в виде поперечных складок, что указывает на «дряблость» паренхимы почки (рис. 1).

Морфологические изменения в почках на 1-й, 3-й, 7‑й дни после воздействия ударных волн были практически однотипными (рис. 2 – 5). Отмечается полнокровие капилляров, базальные мембраны клубочков утолщены, мочевое пространство расширено. В интерстиции коркового слоя мелкоочаговые кровоизлияния, а в переходной зоне — множественные сливающиеся. Выражена дистрофия эпителия канальцев, в просвете — следы белковой жидкости. И лишь на 14-е сутки происходит уменьшение отёка, исчезновение кровоизлияний, нивелирование признаков дистрофии эпителия канальцев, восстановление морфологических структур почки практически до исходного уровня.

Результаты наших исследований продемонстрировали, что, в дополнение к обнаруженным морфологическим изменениям, после ударно-волнового воздействия присоединяется нарушение функции почек.

В таблице 3 представлены показатели, характеризующие функциональную способность почек экспериментальных животных после ДУВВ в динамике с 1-го по 14‑й день наблюдения.

Отмечается достоверное увеличение концентрации креатинина в 1-е сутки после ДУВВ, однако уровень данного маркёра функционального состояния почек остаётся в пределах нормы, составляя 0,68 – 1,02 мг/дл. К 3-м суткам уровень креатинина становится достоверно выше по сравнению с уровнем в предыдущей контрольной точке, выходя за пределы нормальных значений. Высокие уровни креатинина на 3-и и на 7-е сутки не имеют статистически значимых различий между собой, что свидетельствует об установлении определённого плато, обусловленного повреждением как внутрипочечного сосудистого русла, так и элементов нефронов. К 14-м суткам начинает прослеживаться тенденция к снижению уровня креатинина, что согласуется с результатами морфологических исследований.

Несколько иная динамика прослеживается при оценке изменений концентрации мочевины в сыворотке крови. Максимальная концентрация мочевины в сыворотке крови отмечена на 7‑й день со снижением к 14-му дню наблюдения. Однако уровень мочевины остаётся достоверно выше, чем в группе сравнения.

Анализ показателей свободнорадикального окисления белков и липидов нефроэпителия, оценка активности антиоксидантных ферментов и функциональной способности почек экспериментальных животных, а также гистоморфологические изменения после ДУВВ на 1-й, 3-й, 7-й, 14‑й дни исследования позволили уточнить механизм и этапы повреждения и восстановления структурно-функциональных параметров почек крыс (табл. 4).

Обсуждение

Традиционно ДУВЛ считается малоинвазивным и высокоэффективным методом лечения МКБ [14 – 17]. Однако проблема сопутствующего повреждения почечной паренхимы при проведении ДУВЛ остаётся актуальной и нерешённой.

Очевидно, что внедрение в клиническую практику новых информативных критериев оценки степени повреждения почечной паренхимы, сопоставимое по информативности с морфологическими исследованиями, могло бы послужить объективной основой регулирования параметров волнового воздействия и оптимизировать сроки проведения повторных процедур в ходе хирургического лечения нефролитиаза методом ДУВЛ.

Для оценки степени выраженности почечного повреждения в настоящее время предложено большое количество прямых и непрямых маркёров [18][19].

Интерпретируя показатели тех или иных биомаркёров, мы должны учитывать механизм активации экспрессии, время, прошедшее после воздействия повреждающего фактора, исходное состояние функции почек [18].

В нашем исследовании у подопытных животных, которые подвергались ДУВВ, в гомогенате почек были изучены маркёры свободнорадикального окисления белков (белковые карбонильные группы) и липидов полиненасыщенных жирных кислот (малоновый диальдегид), отражающие степень повреждения нефроэпителия. Также в почечном гомогенате определяли ферменты, такие как супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, глутатион восстановленный, отражающие степень антиоксидантной защиты почки.

Проведённое экспериментальное исследование показало, что после ДУВВ на почку экспериментальных животных с 1-го по 3‑й день происходит активация процессов свободнорадикального окисления белков и липидов клеток нефроэпителия. Нормализация показателей радикального окисления белков и липидов происходила с 7-го по 14‑й день наблюдения, что согласуется с результатами других авторов [20 – 22], доказывая, что одним из факторов повреждения при ДУВВ является активация свободнорадикального окисления мембранных липидов и белков клеток нефроэпителия. Показатели антиоксидантной защиты почки после ДУВВ статистически значимо снижали свою функцию на 1 – 2‑й день, восстановление отмечено с 3-го по 14‑й день.

Таким образом, колебания концентраций маркёров свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты отражают сущность патогистологических изменений в результате альтерации почечной паренхимы и позволяют более чётко представить механизмы нарушения почечной функции на фоне ДУВВ. Для подтверждения данных выводов была произведена гистоморфологическая оценка изменений в почках животных после ДУВВ в динамике на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е сутки. При морфологическом исследовании основное внимание обращали на варианты проявления альтеративных изменений, их обратимости, которые отражали выраженность повреждающего действия сфокусированных ударных волн.

Морфологические изменения в почках на 1-й, 3-й, 7‑й дни после ДУВВ были практически однотипны. Отмечалось полнокровие капилляров, базальные мембраны клубочков утолщены, мочевое пространство расширено. В интерстиции коркового слоя — мелкоочаговые кровоизлияния, а в переходной зоне — множественные сливающиеся, выраженная дистрофия эпителия канальцев, в просвете — следы белковой жидкости. Такие острые биоэффекты ударных волн тщательно изучены в нескольких экспериментальных исследованиях с использованием различных животных моделей [23]. Лишь на 14-е сутки произошло уменьшение отёка, исчезновение кровоизлияний, нивелирование признаков дистрофии эпителия канальцев, морфологическая структура почки восстановилась практически до исходного уровня.

Конструктивное развитие и усовершенствование литотриптеров привели к изменению характера и уровней осложнений, поэтому проведение ДУВЛ на аппаратах с различным принципом генерации ударной волны характеризуется неодинаковой степенью травматизации почечной паренхимы [24]. Этим, по всей видимости, объясняются разные сроки восстановления почечной ткани после ДУВВ — от 8 до 35 дней, согласно результатам исследований, проведённых авторами в разные временные периоды [20][23].

В последнее время в поисках улучшения результатов дистанционной литотрипсии и уменьшения повреждающего фактора на почечную паренхиму стали исследоваться альтернативные методики, в частности описанные Н.К. Гаджиевым и соавт. (2021) [25]. Данные устройства используют технологию сфокусированных ультразвуковых волн высокой интенсивности, или «ультразвуковой пропульсии», что позволяет снизить объём поражения почки до 0,1% по сравнению с 5% при ДУВЛ.

С учётом вышеизложенного были уточнены механизмы и временные этапы повреждения и восстановления структурно функциональных параметров почек экспериментальных животных после ДУВВ. Так, с 1-го по 3‑й день происходит активация процессов свободнорадикального окисления белков и липидов нефроэпителия (белковые карбонильные группы, малоновый диальдегид), снижение активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, восстановленный глутатион (GSH)), что в итоге приводит к мембранодеструктивным изменениям, гибели клеток нефроэпителия, альтерации ткани почки. На 7-е сутки выраженные гистоморфологические изменения способствуют снижению функции почек (увеличение мочевины и креатинина в сыворотке крови). Только на 14-е сутки маркёры повреждения почки, её гистоморфологическая структура и функциональная способность приближаются к норме.

Проведённые экспериментальные исследования позволяют достаточно точно судить о том, что изменения в почках животных при ДУВВ носят обратимый характер и восстановление происходит на 14‑й день. Полученные данные позволяют обсуждать возможность и целесообразность повторного ДУВВ на почку не ранее 14 дней после первого сеанса.

Однако нужно отметить, что выявленные повреждения в почках экспериментальных животных после ДУВВ и сроки восстановления относятся только к интактным почкам, так как при изначально сниженной функции почек периоды нормализации активности продуктов СРО и восстановления почечной паренхимы удлиняются [23].

Заключение

Результаты экспериментального исследования позволяют изучить механизмы повреждения почечной ткани, выявить стадийность патоморфологических изменений и функциональных расстройств, установить сроки восстановления почечной ткани после ударно-волнового воздействия.

Ключевые моменты:

1. Концентрация маркёров СРО и АОЗ отражают сущность патологогистологических изменений в почках экспериментальных животных после ДУВВ.
2. С 1-го по 3‑й день происходит активация СРО-белков и липидов нефроэпителия, снижение активности ферментов АОЗ и, как итог, — гибель клеток нефроэпителия, альтерация ткани почки.
3. К 7-м суткам эксперимента развиваются выраженные гистоморфологические изменения в ткани почки со снижением её функции.
4. Изменения в почках экспериментальных животных при ДУВВ носят обратимый характер, восстановление происходит на 14‑й день, что позволяет обсуждать возможность и целесообразность проведения повторного сеанса.
5. Выявленные механизмы и динамика повреждения и восстановления почки после ДУВВ позволяют обосновать необходимость проведения медикаментозной протекторной терапии почки.