Роль генов микроРНК участников VHL-HIF1α пути в развитии светлоклеточного рака почки

Введение

Рак почки (РП) - это гетерогенная группа злокачественных опухолей, подавляющее большинство которых представляют собой почечно-клеточные карциномы различных морфо­логических типов, но наиболее часто встречается светлоклеточный рак почки (СРП). Особое внимание в канцерогенезе СРП уделяется VHL-HIF1α пути. При нормоксии пролиновые остатки в HIFα гидрокислированы, что делает возможным работу VHL-комплекса и убиквитинилирование HIF1α. HIF участвует в регу­ляции многих биологических процессов - доставка кислорода и адаптация к его депривации, пролифера­ция клеток и ангиогенез (через фактор роста эндоте­лия сосудов (VEGF)), тромбоцитарный фактор роста β (PDGF-β) и трансформирующий рост фактор-α (TGF-α)), метастазирование через подавление E-кадгерина [1][2]. Нарушения убиквитин-лигазного комплекса приво­дят к нарастанию концентрации HIF в клетках и при­водит к гиперэкспрессии гипоксией-индуцируемых генов, которые участвуют в положительной регуляции клеточной пролиферации и ангиогенезе.

В настоящее время считается, что большую роль в возникновении злокачественных новообразований играют микроРНК - короткие некодирующие РНК дли­ной 18-25 нуклеотидов, которые взаимодействуют по комплементарному принципу с 3'-нетранслируемыми областями мРНК-мишеней. Согласно имеющим­ся данным, каждая микроРНК может регулировать сотни различных белок-кодирующих генов [2]. Было показано, что многочисленные гены, участвующие в патогенезе СРП, такие как VHL, PTEN, HIF1-α, mTOR, являются мишенями микроРНК [3]. Изменение харак­тера взаимодействия микроРНК с сайтом связывания в результате однонуклеотидной замены может спо­собствовать изменению экспрессии генов-мишеней, задействованных в возникновении и развитии опухо­лей.

Целью данного исследования был анализ роли отдельных полиморфных вариантов в сайтах связыва­ния микроРНК (miRNA) генов VHL-HIF1α пути в разви­тии СРП.

Материалы и методы

В работе использованы 225 образцов ДНК, выде­ленных из венозной крови пациентов со СРП, находя­щихся на стационарном лечении в клинике БГМУ. Кон­трольная группа была сформирована из 298 здоровых неродственных жителей Республики Башкортостан, не имеющих злокачественных новообразований, которые по возрасту, полу, этнической принадлежности и территории проживания соответствовали группе больных. Средний возраст пациентов составил 56,7 года (от 24 до 84 лет на момент постановки диагноза). Забор образцов проводился сотрудниками кафедры урологии в соответствии с этическими стандартами, разработанными Хельсинской декларацией Всемир­ной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием чело­века». У всех обследуемых лиц образцы крови были получены с их информированного согласия. Диагноз был поставлен на основании данных клинического и гистологического обследований.

Определение генотипов полиморфных локу- сов сайтов связывания микроРНК в генах VHL-ΗΙΡα- зависимого пути (rs10982724 гена DEC1, rs406271 гена TFRC, rs10491534 гена TSC1, rs1642742 гена VHL, rs3025033 гена VEGFA) проводили методом аллельной дискриминации Taq-man на приборе CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System. Результаты каждой аллельной дискриминации были проанализированы, используя программное обеспечение CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System. При попарном срав­нении частот генотипов и аллелей в группах больных и здоровых лиц использовался критерий χ2 (Р) для таблиц сопряженности 2х2 с поправкой Йетса на не­прерывность.

Результаты

Проведён анализ полиморфных вариантов в ге­нах VHL- HIFα-зависимого пути у пациентов со СРП и в группе здоровых индивидов. Анализ распреде­ления частот аллелей и генотипов по полиморфным локусам rs10982724 гена DEC1, rs406271 гена TFRC, rs3025033 гена VEGFA между пациентами со СРП и здоровыми индивидами не показал каких-либо ста­тистически значимых различий. При сравнительном анализе частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1642742 гена VHL было показано, что генотип rs1642742*AA(p=0,0165; OR= 0,5978; 95% CI (0,3915­0,9213)) встречался у пациентов со СРП в возрасте 55

лет и старше значительно реже, чем в контрольной группе той же возрастной категории, тогда как генотип rs1642742*GG чаще встречался у пациентов, являясь маркёром повышенного риска развития СРП (табл. 1).

Кроме того, проведён анализ полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1. TSC1 - ген, кодирующий белок туберозного склероза гамартин - ключевой ин­тегратор сигналинга ростовых факторов. Белок TSC1 подавляет рост и пролиферацию клеток, ингибируя мишень комплекс рапамицина 1 в клетках млекопи­тающих.

При сравнении группы больных с учётом тяжести течения заболевания были выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1 (табл. 2).

Выявлено, что аллель rs10491534*C является мар­кёром тяжёлого течения рака почки (p=0.044; OR=1.72 (CI=1.012-2.911)), а генотип rs10491534*T/T (p=0.044; OR=0.55; (95%CI=0.31-0.98)) гена TSC1 - протективным маркёром в отношении развития СРП тяжёлого тече­ния.

Обсуждение

В результате проведённого анализа наиболее значимые ассоциации были выявлены для поли­морфных локусов, расположенных в генах VHL и TSC1. Одним из важных генов-супрессоров опухолевого ро­ста, инактивируемых при светлоклеточном раке поч­ки (СРП) является ген фон Хиппеля-Линдау (VHL, von Hippel-Lindau), локализованный на коротком плече хромосомы 3 в области 3p25-3p26. Основной функ­цией белка VHL является регуляция индуцируемого гипоксией фактора α (ΗΙΡ-1α) путём образования комплекса, обладающего Е₃-убиквитин-лигазной актив­ностью. Moore L.E. et al. показали, что полиморфный вариант rs1642742 гена VHL был связан с риском гиперметилирования VHL-промотора [4]. Случаи СРП с конкретными полиморфизмами зародышевой линии VHL с большей вероятностью имели инактивацию VHL посредством гиперметилирования промотора, чем путем изменения последовательности ДНК в опухоле­вой ткани. Таким образом, можно предположить, что присутствие этих SNP может представлять собой при­мер облегченной эпигенетической вариации (унасле­дованной склонности к эпигенетической вариации) в ткани почки. Мы показали значительно повышенный риск развития СРП у носителей аллеля rs1642742*G в возрасте 55 лет и старше. Такие же результаты были представлены в исследовании Wen-Chung Wang et al., где частота аллеля G в rs1642742 была намного выше при поздних стадиях карциномы почек у пациентов из Тайваня [5].

Гены туберозного склероза TSC1 и TSC2 действу­ют совместно для ингибирования сигнального пути mTOR. Этот универсальный для многих клеток орга­низма путь отвечает за процессы клеточного роста, пролиферации, дифференциации, обладая онкогенной активностью. Известно, что нарушения пути mTOR путём гиперэкспрессии или структурных на­рушений генов, входящих в сигнальный путь, может приводить к злокачественной трансформации клеток [6]. В исследовании Wei H et al. не было показано статистически значимых ассоциаций полиморфно­го варианта rs10491534 с риском развития СРП [2]. Также было показано, что полиморфный вариант rs10491534 гена TSC1 играет важную роль в модули­ровании риска развития вторичных опухолей / реци­дивов [7].

Выводы

Полученные в результате настоящего исследо­вания данные свидетельствуют об ассоциации поли­морфных вариантов сайтов связывания микроРНК с риском развития рака почки, а также тяжестью тече­ния заболевания. Вместе с другими известными эпи­демиологическими, клиническими и генетическими факторами выявленные генетические маркёры могут способствовать выявлению лиц с высоким риском развития рака почки тяжёлого течения. Однако, необ­ходимы дальнейшие исследования изученных генов на независимых выборках для установления их функ­циональной значимости и роли в патогенезе злокаче­ственных новообразований почки.