Газовая хроматография и масс-спектрометрия в диагностике рака предстательной железы: достижения и перспективы

Введение

Рак предстательной железы (РПЖ) занимает третье место по частоте выявления онкологических заболеваний во всём мире, первое место по частоте встречаемости злокачественных новообразований у мужчин. По разным оценкам, в 2020 году число новых случаев заболевания составило 1,4 миллиона, что соответствует 7,3% от общего числа случаев рака [1]. Пятилетняя выживаемость при раннем выявлении локализованного РПЖ может достигать 98%, тогда как при метастатическом процессе она снижается до 30% [2][3]. Таким образом, ранняя диагностика РПЖ имеет решающее значение для повышения общей выживаемости пациентов и, соответственно, снижения уровня смертности.

В настоящее время простатический специфический антиген (ПСА) является наиболее часто используемым биомаркером для диагностики РПЖ. Однако этот диагностический маркер обладает ограниченной чувствительностью и специфичностью и, что особенно важно, является неспособным отличать агрессивную форму РПЖ от индолентной (медленно прогрессирующей) [4]. Общеизвестно, что на уровень ПСА могут влиять такие факторы, как простатит, инфекция мочевыводящих путей, гиперплазия предстательной железы, наличие которых может приводить к повышению уровня общего ПСА, и, следовательно, выполнению неоправданных биопсий предстательной железы. Из-за неспецифического повышения уровня общего ПСА в 2/3 случаев проводится биопсия, результаты которой либо не выявляют РПЖ, либо обнаруживают его клинически незначимую форму [5][6]. С другой стороны, в литературе описаны случаи выявления агрессивного РПЖ и при нормальных значениях уровня ПСА [7]. Тем не менее на настоящий момент выполнение биопсии предстательной железы является обязательным для окончательного диагноза.

Некоторые производные ПСА используются в клинической практике для получения дополнительной информации, позволяющей сократить количество неоправданных биопсий. Так, в недавнем исследовании [8] были рассмотрены различные биомаркеры и тест-системы для диагностики РПЖ, включая PCA3, индекс здоровья простаты, 4KScore, SelectMDx, ConfirmMDx, MiPS и другие, которые показали себя менее экономически выгодными по сравнению с традиционными методами диагностики. Их использование осложняется трудностью интерпретации результатов, которые приобретают диагностическую ценность лишь при достижении экстремальных значений [9].

Отсутствие биомаркера, который бы удовлетворял всем требованиям для диагностики и мониторинга РПЖ, подчёркивает необходимость создания новых неинвазивных, экономически эффективных и высокоточных методов диагностики. Это становится возможно благодаря более глубокому пониманию патофизиологических процессов в опухолевых клетках. Продуктом изменений обмена веществ в опухолевых клетках являются метаболиты, их качественный и количественный состав изучает наука метаболомика, активное развитие которой началось в конце 2000-х годов [10]. Метаболомика занимается систематическим изучением продуктов обмена веществ для выявления уникальных химических профилей, характерных для клеточных процессов. Метаболом представляет собой совокупность всех молекул, образующихся в результате обмена веществ в клетках, тканях, органах или организме [11][12].

Для изучения метаболических изменений в биологических средах применяется метаболомное профилирование — комплексный аналитический подход, направленный на идентификацию и количественное определение продуктов обмена веществ в биологических образцах. Наиболее часто изучаемыми биологическими средами для определения маркеров онкологических заболеваний, в частности РПЖ, являются кровь и моча. Сыворотка крови как биологический субстрат ассоциирована со множеством дополнительных факторов, влияющих на результаты исследования, поскольку в кровь попадают продукты жизнедеятельности клеток различных тканей и органов. Это осложняет выявление в сыворотке крови специфичных для РПЖ соединений. Метаболомное профилирование мочи имеет множество преимуществ по сравнению с сывороткой крови: неинвазивность, лёгкость получения большого количества образцов, и, что особенно важно, в моче по сравнению с сывороткой крови содержится больше метаболитов клеток предстательной железы и меньшее количество белков, которые, будучи крупными молекулами, могут затруднять интерпретацию результатов [13].

Цель исследования: критический анализ литературных источников, посвящённых изучению результатов метаболомного профилирования мочи в диагностике РПЖ с применением метода газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС).

Алгоритм литературного поиска

Для подготовки данной обзорной статьи был проведён целенаправленный анализ научной литературы, представленной в ведущих международных и отечественных библиографических базах данных — PubMed, Medscape и eLibrary. Поиск осуществляли по ключевым словам и их комбинациям: «рак предстательной железы» (“prostate cancer”), «летучие органические соединения» (“volatile organic compounds”, “VOCs”), «газовая хромато-масс-спектрометрия» (“gas chromatography–mass spectrometry”, “GC–MS”), «метаболиты» (“metabolites”), «хроматограмма» (“chromatogram”). Для повышения полноты выборки использовались как русскоязычные, так и англоязычные эквиваленты терминов.

Особое внимание уделялось публикациям, в которых рассматривались методы пробоподготовки, условия проведения газохроматографического анализа, особенности масс-спектрометрической детекции, а также корреляция профилей ЛОС с клиническими характеристиками пациентов. Отдельно анализировались исследования, направленные на сопоставление эффективности ГХ-МС с другими методами неинвазивной диагностики, включая электронные сенсорные системы.

Для обеспечения актуальности информации в обзор включены работы, опубликованные преимущественно в период с 2019 года по 2024 год, когда наблюдался заметный рост интереса к метаболомным и волатиломным подходам в диагностике урологических заболеваний. При этом были учтены результаты, полученные научными коллективами из России, США, стран Европы и Китая, что позволило провести сравнительный анализ региональных подходов к использованию ГХ-МС и другим технологиям анализа ЛОС в клинической практике.

Особенности метаболизма клеток РПЖ

Клетки РПЖ, как и опухолевые клетки других локализаций, стремясь к быстрому росту и делению, требуют усиленного синтеза белка для создания новых клеточных структур. Это достигается за счёт перестройки процессов трансляции, активации генов, регулирующих клеточный цикл, и подавления распада белков. В то же время происходит перестройка протеолитических путей, что может влиять на жизнеспособность и метастазирование опухоли. Белковый метаболизм в клетках РПЖ тесно взаимосвязан с другими процессами в клетке и в её микроокружении [14][15].

Также при РПЖ происходит нарушение углеводного обмена (рис. 1): раковые клетки проявляют повышенную гликолитическую активность даже при наличии кислорода, что известно в литературе как «эффект Warburg». Усиленный гликолиз приводит к повышенному поглощению глюкозы и синтезу лактата, а также к запуску гликогенолиза для быстрого доступа к глюкозе. В клетках ацинарной аденокарциномы увеличивается метаболизм глюкозы через пентозофосфатный путь (ПФП), что способствует синтезу никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), обеспечивая опухоль дополнительной энергией [16][17]. Кроме того, эти клетки теряют способность накапливать цинк, что снижает накопление цитрата, необходимого для энергии. Для поддержания окисления цитрата требуются изменения в метаболизме жирных кислот, обеспечивающие клетки АТФ и ацетил-КоА. Наряду с этими изменениями в раковых клетках предстательной железы развивается гиперэкспрессия генов глутамина и глутаминазы, что в итоге изменяет окисление цитрата и способствует росту опухоли за счёт усиленного синтеза липидов даже в условиях гипоксии [18][19].

Изменения липидного обмена при РПЖ охватывают процессы синтеза, депонирования и катаболизма липидов [20]. Одним из ключевых нарушений является дисрегуляция липогенеза, при которой раковые клетки усиливают производство жирных кислот и других липидных компонентов для поддержания быстрого роста. Это усиление липогенеза часто связано с активацией ключевых ферментов, таких как АТФ-цитрат-лиаза и ацетил-КоА-карбоксилаза, под воздействием онкогенных сигнальных путей, включая ось PI3K/Akt/mTOR и MYC [21]. Кроме того, раковые клетки изменяют поглощение и утилизацию липидов, используя как эндогенные, так и экзогенные источники для удовлетворения своих метаболических потребностей, что является характерной особенностью метаболизма клеток ацинарной аденокарциномы [17].

Основы хромато-масс-спектрометрии

Благодаря успехам в изучении метаболизма опухолевых клеток, в частности клеток ацинарной аденокарциномы предстательной железы, новым, многообещающим и неинвазивным методом выявления онкологических заболеваний, в частности РПЖ, становится исследование эндогенных летучих органических соединений (ЛОС) в биологических жидкостях. «Золотым стандартом» качественного и количественного определения веществ в различных средах является масс-спектрометрия, которая часто комбинируется с другими методами (газовая и жидкостная хроматография), которые позволяют увеличить эффективность диагностики [22].

Масс-спектрометрия — это аналитический метод, который используется для определения состава веществ на основе их массы и заряда. Результатом работы масс-спектрометра является масс-спектр — график, показывающий распределение ионов по их массовым числам. Этот спектр позволяет идентифицировать вещества и количественно оценивать их содержание в образце. Для интерпретации результатов масс-спектрометрии необходимо наличие высококвалифицированного специалиста с соответствующим химическим образованием, обладающего глубокими знаниями в области аналитической химии и масс-спектрометрии.

Газовая хроматография используется для разделения летучих и полулетучих соединений. Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией позволяет не только идентифицировать вещества, но и количественно определять их содержание, что значительно повышает аналитические возможности метода (рис. 2). Жидкостная хроматография, в свою очередь, используется для анализа более полярных и термически нестабильных соединений [22][23].

Развитие методов масс-спектрометрии, характеризующихся высокой чувствительностью и разрешающей способностью, сыграло ключевую роль в становлении метаболомики как перспективного научного направления, открывающего новые возможности для ранней диагностики рака предстательной железы. Использование этих передовых аналитических платформ в метаболомных исследованиях способствовало выявлению специфических биомаркеров, ассоциированных с РПЖ [24].

ГХ-МС в метаболомном профилировании мочи пациентов с РПЖ

Концепция, согласно которой биологические жидкости могут отражать здоровье человека, уходит корнями в глубокое прошлое. Древнекитайские медики привлекали муравьёв для определения уровня глюкозы в моче и диагностики диабета [25]. В эпоху Средневековья применялись так называемые «мочевые карты», которые позволяли соотнести цвет, вкус и запах мочи с разнообразными медицинскими состояниями, основанными на метаболических процессах [26].

Идея индивидуального «метаболического профиля», отражающего состав биологических жидкостей, была впервые выдвинута Роджером Уильямсом в конце 1940-х годов: уникальные метаболические профили в моче и слюне могут быть связаны с таким заболеванием, как шизофрения [27]. Термин «метаболический профиль» был официально введён в научный обиход в 1971 году Э. Хорнингом, когда было доказано, что ГХ-МС может использоваться для идентификации ЛОС в моче человека [28]. В 2007 году команда Университет Альберты (Канада) во главе с D.S. Wishart завершила работу над первой версией базы данных «Метаболом человека», включающей сведения о 2500 метаболитах, 1200 лекарственных препаратах и 3500 продуктах питания [29][30].

В большинстве метаболомных исследований распространены два подхода: таргетный (целевой) и нетаргетный («панорамный») [31][32]. Первый подразумевает целенаправленную стратегию, которая предполагает выявление выбранной группы метаболитов с установленной клинической значимостью [33]. При нетаргетном подходе измеряется большое количество метаболитов разных химических классов без предварительного отбора, что позволяет выявить множество новых потенциальных биомаркеров, ассоциированных с изучаемым заболеванием. Нетаргетный подход в исследовании метаболома мочи, а также других биологических жидкостей осуществляется с помощью двух стратегий: метаболомного профилирования и фингерпринтинга [34]. Метаболомное профилирование связано с количественным определением всех измеряемых метаболитов в биологическом образце, в то время как метаболомный фингерпринтинг определяет уникальные метаболические паттерны, обнаруженные во всем метаболоме, которые могут быть ассоциированы с определённым заболеванием или биологическим состоянием [33].

В конце 2000-х годов группа исследователей под руководством академика А.И. Арчакова из Института биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича провела исследование, направленное на оценку эффективности метаболического фингерпринтинга плазмы крови для диагностики клинически значимого РПЖ. Результаты исследования показали, что данный метод обладает высокой чувствительностью (95%), специфичностью (96,7%) и точностью (95,7%) при диагностике клинически значимого РПЖ. Очевидно, что эти данные значительно превосходят результаты традиционного иммуноферментного теста на ПСА, который широко используется в клинической практике [35][36]. Также в исследовании П.Г. Лохова и соавт. (2009) были выявлены два метаболита — ацилкарнитин и арахидоноиламин, которые продемонстрировали значительно более высокие значения площади под кривой (Area Under the Curve (AUC)) (0,97 и 0,86 соответственно) по сравнению с определением уровня общего ПСА (0,59), что указывает на то, что эти метаболиты могут обладать более высокой точностью в определении наличия РПЖ [37].

Одним из ключевых исследований, посвящённых определению биомаркеров РПЖ на основе метаболомного анализа, является работа A. Sreekumar et al. (2009), когда впервые было выявлено органическое соединение — саркозин, являющееся одним из конечных продуктов распада белков, уровень которого может значительно увеличиваться при метастатическом РПЖ [38]. Диагностические характеристики этого маркера изучались на разных стадиях прогрессирования РПЖ и измерялись в моче, сыворотке, плазме и биоптатах предстательной железы. Сперва саркозин был идентифицирован как потенциальный биомаркер РПЖ в моче, концентрация которого значительно увеличивается при прогрессировании заболевания. Однако до сегодняшнего дня роль саркозина в процессах канцерогенеза до конца не изучена, и результаты исследований по применимости этого биомаркера показывают противоречивые результаты [39][40].

Е. Tsouko et al. (2014) провели детальное исследование метаболических изменений в клетках РПЖ [16]. Они обнаружили, что активация андрогенного рецептора приводит к повышению уровней глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) — ключевого фермента ПФП. Это способствует усиленному синтезу НАДФ и рибозы, необходимых для анаболических процессов и защиты от оксидативного стресса в раковых клетках. Кроме того, ингибирование mTOR (мишени рапамицина у млекопитающих) рапамицином прекращало активацию Г6ФД, указывая на взаимосвязь между сигнальными путями андрогенных рецепторов, mTOR и активацией ПФП. Эти результаты подчёркивают критическую роль ПФП в поддержании роста клеток РПЖ, так как он обеспечивает их необходимыми метаболитами и восстановительными эквивалентами, такими как НАДФ.

T. Khalid et al. (2015) изучали ЛОС мочи у пациентов с повышенным уровнем общего ПСА с помощью ГХ-МС. В основную группу пациентов с РПЖ были включены 59 пациентов, в контрольную — 43 [41]. Образцы мочи были собраны в день выполнения биопсии предстательной железы, выполненной по поводу повышенного уровня общего ПСА. В моче были выявлены 4 ЛОС (2,6-диметил-7-октен-2-ол, пентанал, 3-октанон и 2-октанон), которые позволяли выявить РПЖ с точностью 63 – 65%, при точности ПСА — 62 – 64%. Сочетание ПСА с ГХ-МС повышало показатель точности до 74%.

Аналогичным образом Q. Gao et al. (2019) исследовали ЛОС газовой фазы мочи методом ГХ-МС в группе из 108 пациентов, которым была выполнена биопсия предстательной железы: у 55 пациентов по результатам биопсии был подтверждён РПЖ, у 53 пациентов не выявлен онкологический процесс (контрольная группа). В ходе исследования была создана диагностическая модель, включающая 11 ЛОС, с полученной площадью под кривой, равной 0,86 [42]. В отличие от исследования T. Khalid et al. (2015), группа Q. Gao et al. (2019) проанализировала большее количество образцов мочи и провела дополнительную валидацию своей модели на новой («внешней») когорте пациентов, что значительно повысило надёжность диагностической модели, достигнув чувствительности 96% и специфичности 80%. Результаты исследования ограничены недостаточной точностью биопсии предстательной железы: у пациентов с отрицательным результатом биопсии предстательной железы мог быть латентно протекающий РПЖ, участки которого могли не попасть в биоптаты; ограниченное количество участников исследования, а также в исследовании не учитывались следующие факторы: время сбора мочи, диета, риск заболевания, генетический профиль и воздействие окружающей среды [42].

В недавнем исследовании A.A. Laskar et al. (2018) было выявлено, что метаболизм опухолевых клеток обычно сопровождается повышенной активностью ацетальдегид-дегидрогеназы, которая катализирует окисление экзогенных и эндогенных альдегидных субстратов до соответствующих им карбоновых кислот [43]. Эти данные объясняют снижение количества альдегид-содержащих ЛОС у пациентов с РПЖ.

A.R. Lima et al. (2020) изучали метаболический профиль газовой среды мочи у пациентов с РПЖ и пациентов контрольной группы без онкологического заболевания с помощью сочетания ГХ-МС и протонного магнитного резонанса [44]. В исследование были включены 41 пациент с РПЖ и 42 пациента контрольной группы. Были выявлены 15 метаболитов, отличающих образцы мочи пациентов обеих групп. Данные метаболиты, как было установлено, вовлечены в процессы метаболизма аминокислот и энергетического метаболизма. Чувствительность, специфичность и точность сочетанной методики анализа составила 89%, 89% и 86% соответственно.

C. Yu et al. (2021) изучали метаболиты мочи, характерные для РПЖ. В исследование были включены 89 пациентов с РПЖ, 84 пациента с ГПЖ и 70 здоровых испытуемых [45]. Профиль ЛОС мочи изучался с помощью ГХ-МС. В группе РПЖ были выявлены изменения, отсутствующие в двух других группах и связанные с нарушением цикла трикарбоновых кислот, метаболизма жирных кислот, системы расщепления глутамина. Выявление метаболитов РПЖ в моче показало специфичность — 53,2 %, в сочетании с определением общего ПСА — 66,9%. Несмотря на полученные относительно низкие результаты специфичности, авторы отмечают, что выявленные метаболические изменения мочи могут быть ценным источником в поиске новых метаболических маркеров РПЖ.

W. Wang et al. (2021) изучали возможность выявления химических соединений газовой фазы мочи, характерных для РПЖ. В проспективном исследовании участвовали 41 пациент с РПЖ и 38 пациентов контрольной группы с диагнозом «гиперплазия предстательной железы» (ГПЖ) [46]. Было установлено, что нарушение метаболизма жирных кислот в клетках РПЖ ассоциировано с повреждением при РПЖ генов: SPTLC3, MYLK, SGK1, GNMT и GSF1. Авторы выявили 3 химических вещества, отличающих мочу пациентов основной и контрольной групп: L-серин, мио-инозитол и деканоиновая кислота, метаболизм данных веществ связан с мутациями в вышеуказанных генах. Выявление вышеуказанных ЛОС мочи способствовало улучшению диагностики, повышая показатель площади под кривой до 0,781, в то время как для общего ПСА он составляет 0,592. Результаты исследования ограничены сравнительно небольшой выборкой пациентов.

Q. Liu et al. (2023) изучали мочу пациентов с верифицированным РПЖ (66 пациентов) и пациентов контрольной группы (87 пациентов) с помощью ГХ-МС. В ходе исследования были выявлены 86 ЛОС, отличающих образцы мочи пациентов обеих групп [11]. Из 86 ЛОС 4 соединения были ассоциированы с РПЖ с площадью под кривой более 0,9, при этом концентрация одного из этих соединений (фуран-3-метанол) статистически значимо отличалась в группах пациентов с РПЖ низкого, промежуточного и высокого рисков. В выявлении характерных для РПЖ ЛОС использовались 4 метода машинного обучения: метод опорных векторов (SVM), алгоритм случайного леса (RF), метод с применением нейросетей (NN), а также метод схемы решений (DT). Наилучшие результаты показали методы SVM и RF: площадь под кривой составила более 0,9; чувствительность — 87% для обоих методов, специфичность — 91,3 и 95,7% соответственно. Методики NN и DT показали менее точные результаты.

G. Riccio et al. (2023) исследовали ЛОС мочи пациентов с РПЖ и пациентов контрольной группы без онкологического заболевания с помощью ГХ-МС [47]. Были выявлены 147 метаболитов различных химических классов, которые были ассоциированы с наличием РПЖ. В исследовании приняли участие 26 пациентов с РПЖ и 30 пациентов контрольной группы. Обработка данных осуществлялась с помощью «метода регрессии частных наименьших квадратов» (PLS-DA). Чувствительность выявления РПЖ составила 100%, специфичность — 83,3%, точность исследования — 91,3%. Ограничением данного исследования являлась небольшая выборка пациентов.

Многие белки были определены как потенциальные кандидаты на роль биомаркеров в результате комплексного анализа мочи с использованием протеомных технологий, однако ни один из них пока не вошёл в клиническую практику. Высокая чувствительность и специфичность некоторых метаболитов делают их перспективными для использования в клинической практике для диагностики РПЖ (табл.). Однако наличие большого разнообразия метаболитов подчёркивает необходимость создания крупных баз данных и сравнительной оценки точности выявления РПЖ. Важно учитывать, что разные метаболиты могут быть более или менее эффективными маркерами в зависимости от стадии заболевания и индивидуальных особенностей пациента.

Тем не менее внедрение метода в клиническую практику ограничивается сложностью и дороговизной оборудования и специализированного программного обеспечения, необходимостью наличия специалистов с высоким уровнем подготовки в области аналитической химии и биохимии, а также отсутствием стандартизированной методики пробоподготовки. Это создаёт трудности для изучения конкретных метаболитов в крупных многоцентровых исследованиях, включающих гетерогенные популяции, что затрудняет оценку применимости исследуемых биомаркеров в клинической диагностике РПЖ.

Заключение

ГХ-МС мочи является многообещающим методом диагностики РПЖ, так как позволяет выявить ЛОС, характерные для опухолевой трансформации клеток предстательной железы. Результаты проведённых исследований с применением ГХ-МС мочи показывают впечатляющие результаты по сравнению со стандартными методами диагностики, однако различие метаболитов в разных исследованиях, отсутствие общедоступных баз данных метаболитов, а также технические трудности при проведении исследования пока не позволяют рутинно применять его в клинической практике. Сегодня метаболомика считается «молодой» научной дисциплиной, её будущее развитие будет определяться рядом факторов, включая совершенствование технической основы аналитических методов, в частности ГХ-МС.