Неоваскулген® и Ботокс® в сравнительном анализе влияния на структуру и функцию мочевого пузыря при интерстициальном цистите (экспериментальное исследование)

Введение

Интерстициальный цистит (ИЦ) являет собою неинфекционное хроническое заболевание с симптомами мочепузырной боли и нижних мочевых путей [1]. Основные причины ИЦ остаются неизвестными, а патофизиологические теории его развития многочисленны: повышение уротелиальной проницаемости, воспаление, хронический стресс, аутоиммунная сенсибилизация [2 – 4].

Для исследования новых методов лечения ИЦ были разработаны доклинические модели на животных [5][6]. Некоторые из этих моделей позволяют имитировать основные симптомы и признаки ИЦ [7, 8]. Вместе с тем, принимая во внимание сложность и недоизученность патофизиологии ИЦ, ни одна модель не способна в полной мере воспроизвести все аспекты возникновения и развития заболевания. Так или иначе, считается, что сенсорная гиперчувствительность афферентных нервов мочевого пузыря и воспаление его стенки на всю толщу являются основными патофизиологическими факторами, презентующими симптомы и постепенное уменьшение объема мочевого пузыря за счёт фиброзирования его стенки [9].

Известен широкий спектр методов лечения, направленных на купирование симптомов и их прогрессию. Отсюда и множество моделей ИЦ на животных с испытанием различных препаратов и их комбинаций [10]. Так, в последние годы были проведены исследования с внутрипузырными введениями препарата ботулинического токсина типа А, гиалуроновой кислоты, аутоплазмы, обогащённой тромбоцитами, причём на модели циклофосфамид-индуцированного цистита [6][11 – 13]. Именно она стала наиболее используемой моделью воспроизводства ИЦ, будучи предложенной Т. Sakata et al. в 1989 году (acrolein — активный метаболит cyclophosphamide) [14].

В дальнейшем группа D.E. Bjorling et al. (2007) опубликовала результаты исследований на мышах, которые подтвердили выводы Т. Sakata et al. (1989) о том, что введение циклофосфамида грызунам вызывает острый геморрагический цистит, постепенно снижающий ёмкость мочевого пузыря за счёт некроза и фиброза тканей стенки органа [14][15].

Таким образом, было постулировано, что использование данной модели является валидным инструментом для моделирования элементов такой патологии, как ИЦ.

Так как лечение ИЦ в настоящий момент остаётся нерешенной задачей, то продолжают разрабатываться новые различные варианты лечения этой патологии, в том числе с применением продуктов биотехнологии.

Препарат Неоваскулген® (АО «НекстГен», Россия) — высококачественная сверхскрученная плазмида pCMV-VEGF165, кодирующая эндотелиальный фактор роста сосудов под контролем промотора (управляющего участка ДНК). При проникновении молекул плазмиды внутрь клеток млекопитающих происходит выработка фактора роста эндотелия сосудов (VEGF; англ. Vascular endothelial growth factor), что приводит к росту кровеносных сосудов (васкуляризации) в области введения. Проникновение плазмиды внутрь клеток является спонтанным процессом, причём размножаться в клетках млекопитающих плазмидная ДНК не может. Особенностью сверхскрученной кольцевой ДНК является чувствительность к разрыву одной из 9116 фосфодиэфирных химических связей. Молекула ДНК с единственной разорванной связью теряет сверхчувствительность, переходя в релаксированную кольцевую форму (родственное соединение) [16].

Препарат создан в качестве лечебного средства в популяции пациентов с многоэтажным поражением артерий нижних конечностей, дистальной формой атеросклероза, в том числе в сочетании с диабетической ангиопатией, то есть в случаях, когда стандартная реваскуляризация по поводу окклюзионного поражения периферических артерий не может быть проведена [17].

Целью исследования является изучение эффектов фармакологической активности препарата Неоваскулген® в сравнении с препаратом Ботокс® (Allergan Pharmaceuticals, Westport, Ireland) на модели ИЦ у крыс, вызванного циклофосфамидом.

Материалы и методы

Данное исследование было рассмотрено биоэтической комиссией АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» и одобрено для проведения (БЭК № 2.60/21 от 08 декабря 2021 года).

Животные и их содержание. Крысы Wistar, самки 164 – 230 граммов в возрасте 6 – 8 недель на начало эксперимента, всего 90 голов (питомник АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», Россия). Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях, и Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных в контролируемых условиях окружающей среды, корма и водопоя ad libitum.

Эвтаназию проводили с помощью диоксида углерода с последующим удалением жизненно важных органов.

Индукция ИЦ. Для моделирования экспериментального цистита (ЭЦ) у крыс использовали внутрибрюшинное введение препарата Эндоксан® (Baxter Oncology GmbH, Halle (Westfalen), Germany; МНН — циклофосфамид). Учитывая тот факт, что однократное введение циклофосфамида вызывает острые изменения в структуре тканей мочевого пузыря, после чего у грызунов отмечается восстановление функциональности органа, хронического течения цистита достигали за счёт многократного введения индуктора [18][19].

Препарат вводили внутрибрюшинно один раз в три дня, всего 3 введения (табл. 2), в дозе 100 мг/кг. В день введения индуктора 200 мг Эндоксана® смешивали с 20 мл раствора NaCl 0,9%. Для крысы массой тела 200 г объём введения составлял 2 мл, что не превышало максимально допустимых значений для данного вида животных [20].

Экспериментальная терапевтическая схема. Исследование носило сравнительный характер с эскалацией дозы Неоваскулгена® в сравнении с препаратом Ботокс® (Allergan Pharmaceuticals, Westport, Ireland) и их комбинации. Дизайн исследования и график манипуляций представлены в таблицах 1 и 2.

Процедура введения препаратов в мочевой пузырь крыс. Неоваскулген® и Ботокс® вводили в виде свежеприготовленного раствора. Животным групп 2 – 9 осуществляли внутридетрузорное введение препаратов в асептических условиях. Использовали комбинированную внутривенную анестезию (Трамадол в дозе 12,5 мг/кг + Пропофол в дозе 10 мг/кг). Внутридетрузорное введение препарата осуществляли после обеспечения полного хирургического доступа к мочевому пузырю классическим способом по белой линии живота. Фиксацию мочевого пузыря производили на пинцетах, после чего с внешней стороны органа внутридетрузорно вводили Неоваскулген®, Ботокс® или их сочетание методом последовательных инъекций в рандомные места по 10 – 15 мкл до достижения соответствующей дозы исследуемых объектов с помощью шприца-дозатора Hamilton объёмом 50 мкл (рис. 1).

Введение конкретной дозы препаратов в каждой группе осуществляли путём определённого количества инъекций: для препарата Неоваскулген® в дозах 5 мкг/кг и 20 мкг/кг — 1 инъекция; в дозе 80 мкг/кг — 4 инъекции; для препарата Ботокс® — 3 инъекции. В группах 3 и 4 с комбинированным введением препаратов количество инъекций составило 4, а в группе 5 — 7 инъекций. Животным группы 2 выполняли 7 инъекций воды для инъекций в качестве контрольного вещества.

Интактным животным выполняли только лапаротомию. Всем животным обеспечивали обогрев и индивидуальное послеоперационное содержание.

Цистометрия. Для сравнительной оценки функционального состояния детрузора от каждой из групп произвольным образом отбирали по 6 животных для выполнения цистометрии. Из них были исключены модели, у которых в результате формирования патологии мочевые пузыри были заполнены сгустками крови, что препятствовало регистрации показателей цистометрии. Таким образом, цистометрии подверглись следующие группы:

— группа 2 — 4 животных (гибель одного животного, второе имело сгустки крови в мочевом пузыре);

— группа 4 — 5 животных (одно животное со сгустками крови в мочевом пузыре);

— группа 5 — 5 животных (гибель одного животного);

— группа 6 — 5 животных (одно животное со сгустками крови в мочевом пузыре);

— группа 7 — 4 животных (гибель одного животного, второе имело сгустки крови в мочевом пузыре);

— группа 8 — 3 животных (гибель 4 животных, три имели сгустки в мочевом пузыре).

Для измерения давления использовали калиброванное оборудование в следующей комплектации: MLT844 Physiological Pressuer Transducer (ADInstruments Ltd., Sydney, Australia) + MLAC20 Interface Cable for MLT844 Physiological Pressuer Transducer (ADInstruments Ltd., Sydney, Australia) + Bridge Amp FE221 (ADInstruments Ltd., Sydney, Australia), которое подключали к регистратору PowerLab 8/30 ML 870/P (ADInstruments Ltd., Colorado Springs, CO, USA). Запись данных осуществляли с помощью программного обеспечения LabChart6 (ADInstruments Ltd., Colorado Springs, CO, USA).

Животных вводили в наркоз путём ингаляционной анестезии (Изоник 1000 мг/г при 3%-м содержании изофлурана + 5 мл/ч кислород), после чего обеспечивали доступ к мочевому пузырю, проводили цистотомию, в полость мочевого пузыря вводили патрубок Tubing-PE 50 Catheter SP0109, (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA) с небольшой манжеткой. Для фиксации трубки накладывали кисетный шов вокруг трубки для герметичности мочевого пузыря (рис. 2).

Свободный конец трубки подсоединяли к аппаратуре для регистрации давления через 3-ходовой медицинский клапан. Также к клапану с помощью трубки подсоединяли шприц, заполненный физиологическим раствором и подключённый к инфузионному насосу BYZ-810 (Changsha Beyond Medical Devices Co. Ltd., Changsha Yuelu District High Tech Park, Hunan Province, PRC). Регистрацию давления в мочевом пузыре осуществляли при постоянном наполнении со скоростью 100 мкл/мин. (6 мл/час) на протяжении 10 минут (рис. 3).

В результате анализа полученных данных рассчитывали следующие показатели:

— базовое внутрипузырное давление (давление после мочеиспускания);

— максимальное внутрипузырное давление во время мочеиспускания;

— частота мочеиспусканий (количество мочеиспусканий за исследование).

Оценка состояния животных. Оценку состояния животных осуществляли по показателям общего клинического наблюдения при осмотре в клетке, на открытой площадке и при взятии в руки, а также при регистрации изменения массы тела.

В конце экспериментальной части, а именно перед цистометрией, регистрировали гибель животных, непосредственной причиной которой стала острая сердечная недостаточность: группа 2 (ИЦ + вода для инъекций) — 1 самка; группа 5 (ИЦ + Неоваскулген® + Ботокс® в дозе 80 мкг/кг + 30 ЕД/кг) — 1 самка; группа 7 (ИЦ + Неоваскулген® в дозе 20 мкг/кг) — 1 самка; группа 8 (ИЦ + Неоваскулген® в дозе 80 мкг/кг) — 4 самки.

Морфологические исследования биологического материала. Морфологические исследования, световая микроскопия с окраской гематоксилин-эозином при 40- и 100-кратном увеличении и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование, проводили всем выжившим в эксперименте животным, неинформативные гистологические срезы исключали из анализа. После эвтаназии животные были тщательно обследованы на предмет внешних патологических изменений в мочевом пузыре, явные визуальные изменения фотографировали. Для дальнейшего гистологического исследования мочевые пузыри фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина в течение 24 часов.

Образцы стенки мочевого пузыря по общепринятой методике заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 5 – 7 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. Анализ гистологических препаратов проводили при помощи светооптического микроскопа Accu-Scope 3000 SERIES (ACCU-SCOPE Inc., Commack, NY, USA) при увеличении ×40 и ×100, а микрофотографирование — при помощи цифровой фотокамеры TOUPCAM UCMOS05100KPA (Hangzhou ToupTek Photonics Co., Ltd., Hangzhou, Zhejiang, PRC) и программного обеспечения ToupView 3.7.7892.

Для ИГХ-исследования образцы мочевого пузыря подвергали стандартной гистологической пробоподготовке. В качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела к циклооксигеназе 2-го типа (ЦОГ-2) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) в разведении 1:100 и кроличьи поликлональные антитела к EP4 Receptor в разведении 1:100 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) по 200 мкл на образец. В качестве системы визуализации для первичных антител использовали систему детекции PrimeVision (ПраймБиоМед, Москва, Россия)

Морфологический анализ проводили при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss Axio Scope A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany) при увеличении ×200 и ×400. Микрофотографирование осуществляли при помощи цифровой фотокамеры AxioCamICc 1 и программного обеспечения Zen 2021 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany).

Полуколичественную оценку экспрессии маркеров выполняли классическим методом по аналоговой шкале (табл. 3).

Затем подсчитывали число клеток каждой интенсивности и рассчитывали индекс (H-score) классическим методом [21], сравнение исследованных групп проводили по данному индексу.

Статистический анализ. Статистический анализ выполняли с помощью лицензионного программного обеспечения Statistica 10.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA).

Данные проверяли на соответствие закону нормального распределения (критерий Shapiro-Wilk). В случае нормального распределения рассчитывали среднее значение (М), стандартное отклонение (SD). В случае несоответствия данных закону нормального распределения рассчитывали медиану (Ме) и квартильный размах [Q1; Q3].

Межгрупповые различия анализировали параметрическими или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения:

— для оценки данных с признаками нормального распределения использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и дисперсионный анализ с повторными измерениями;

— зависимые данные предварительно проверяли на сферичность дисперсий с помощью теста cферичности Mauchly’s. В случае невыполнения предположения о сферичности дисперсий применяли дисперсионный анализ с поправкой Greenhouse-Geisser. При обнаружении достоверного влияния исследуемого фактора последующие межгрупповые сравнения проводили с использованием критерия Tukey;

— независимые данные проверяли на гомогенность дисперсий с помощью критерия Levene. При обнаружении достоверного влияния исследуемого фактора последующие межгрупповые сравнения проверяли с использованием критерия Tukey;

— для данных, не подчиняющихся закону нормального распределения, а также полуколичественных данных (баллы), применяли критерий Kruskall-Wallis, с последующим множественным сравнением средних рангов (критерий Dunn).

Различия определяли при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

Общее состояние животных

На фоне циклофамид-индуцированного ИЦ у животных всех групп регистрировали симптомы боли и дистресса (атаксия, взъерошенность шерсти, признаки угнетения, выделения из носа и глаз), поллакиурию, гематурию, кровь в кале, характерные для моделируемой патологии.

На фоне ухудшения общего состояния у моделей, получавших комбинацию Неоваскулген® + Ботокс®, фиксировали статистически значимое снижение массы тела с 3 – 4-го дня эксперимента. В группах монотерапии статистически значимое снижение массы тела животных обнаруживали с 6 – 7-го дня эксперимента.

Цистометрия

Циклофосфамидный ИЦ у животных сопровождался признаками нарушенного мочеиспускания и детрузорной дисфункции. Так, у животных группы 2 (индуцированный ИЦ + вода для инъекций) определены значимые повышения базового и максимального пузырного давления, а также учащение мочеиспусканий относительно данных группы 1 (интактные животные), где p < 0,05.

Введение лечебных препаратов оказало влияние на все исследуемые уродинамические показатели. Так, базовое внутрипузырное давление значимо уменьшилось у животных групп 4 – 9 (p < 0,05) и стало сравнимо с таковым в группе 1. При этом более эффективной оказалась комбинация Неоваскулген® + Ботокс® в дозировках 20 мкг/кг + 30 ЕД/кг (группа 4) и 80 мкг/кг + 30 ЕД/кг (группа 5), а также препарат Неоваскулген® в дозе 80 мкг/кг (группа 8).

На снижение максимального внутрипузырного давления оказали наибольшее влияние препараты Неоваскулген®, 5 и 20 мкг/кг (группы 6 и 7), Ботокс®, 30 ЕД/кг (группа 9), а также их комбинация при минимальной (группа 3) и средней (группа 4) дозе Неоваскулгена® (p < 0,05). В остальных группах динамика показателя была минимальна и не имела статистической значимости.

Оценка частоты мочеиспусканий показала, что наибольшее соответствие этого параметра контрольным значениям достигнуто в группах 9 (Ботокс®, 30 ЕД/кг), 7 (Неоваскулген®, 20 мкг/кг) и 8 (Неоваскулген®, 80 мкг/кг) (p < 0,05). В группах 6 (Неоваскулген®, 5 мкг/кг) и 4 (Неоваскулген®, 20 мкг/кг + Ботокс®, 30 ЕД/кг) значимого снижения частоты мочеиспусканий отмечено не было (p ≥ 0,05).

В совокупности полученных данных наиболее точное и статистически значимое соответствие анализируемых параметров данным контрольной группы получено в группах 9 (Ботокс®, 30 ЕД/кг) и 7 (Неоваскулген®, 20 мкг/кг) (табл. 4, рис. 4 – 6).

Морфологические исследования

Световая микроскопия с окраской гематоксилин-эозином. Гистологическая оценка стенки мочевого пузыря интактных животных (группа 1) не выявила патологических изменений (рис. 7). Напротив, у всех животных групп 2 – 9 были обнаружены гистологические признаки цистита в виде утолщения стенки мочевого пузыря за счёт отёка, кровоизлияний различной степени выраженности, диффузно-очаговой инфильтрации слизистой и мышечной оболочек мочевого пузыря различной степени выраженности, представленная в основном макрофагами, лимфоцитами и плазмоцитами. В единичных случаях отмечены небольшие группы нейтрофилов. Воспалительные изменения были представлены множественными очагами некроза слизистой оболочки, подслизистой основы, в редких случаях деструкция распространялась на мышечную оболочку. В некоторых очагах некроза слизистой оболочки имелись участки кальцификации.

Следует отметить, что в группах 7 и 9 гистологические изменения в виде отёка, очагов кровоизлияний, клеточной инфильтрации и некрозов были выражены значительно слабее в сравнении с группой 2. Однако ещё меньшая клеточная инфильтрация была отмечена в группе 4 (рис. 8 – 9).

Иммуногистохимическая оценка. ИГХ-исследование препаратов интактных животных (группа 1) определило отсутствие иммунопозитивной окраски. Индексы экспрессии ЦОГ-2 и PGE2 (ЕР4), полученные в данной группе, были приняты за базовые значения и имели значимые отличия от подобных во всех исследуемых группах при последующем сравнении.

Введение Эндоксана® (группа 2) ожидаемо привело к формированию воспалительного процесса, что обусловило значимое повышение индексов экспрессии ЦОГ-2 (p < 0,05) и PGE2 (ЕР4) (p > 0,5).

В группах 3 и 4 определяется снижение экспрессии индексов ЦОГ-2 и PGE2 (EP4) в сравнении с данными группы 2 (p > 0,05), однако повышение дозы Неоваскулгена® до максимальной при сочетании с Ботоксом® (группа 5) нивелирует эти различия. В то же время введение только Неоваскулгена® в минимальной и средней концентрациях (группы 6 и 7) сопровождается более значимым влиянием на снижение экспрессии ЦОГ-2 и PGE2 (EP4) в сравнении с комплексом Неоваскулген® + Ботокс® (p < 0,05). Но максимальная концентрация Неоваскулгена® (группа 8) также не оказывает значимого эффекта на динамику индексов экспрессии ЦОГ-2 и PGE2 (EP4) (p > 0,05).

Необходимо отметить, что наибольшее влияние в подавлении экспрессии ЦОГ-2 и PGE2 (EP4) оказывают как Неоваскулген® в дозе 20 мкг/кг (группа 7), так и Ботокс® 30 Ед/кг (группа 9), указанные различия имеют статистическую значимость в сравнении с данными группы 2 (p < 0,05) и не различаются между группами 7 и 9 (p > 0,05). (табл. 5, рис. 10 – 13).

Рисунок 10. Группа 1. Стенка мочевого пузыря, ув. ×200. А — ИГХ-окраска на ЦОГ-2. В — ИГХ-окраска на EP4 Receptor. Отсутствие иммунопозитивной окраски

Обсуждение

В разработке моделей ИЦ на животных был достигнут значительный прогресс [22]. Однако маловероятно, что модели на животных смогут идеально воспроизвести патофизиологические процессы в мочевом пузыре, подобные ИЦ людей. Тем не менее использование наиболее точных моделей имитации ИЦ крайне важно для разработки и изучения новых методов лечения и прежде всего новых лекарственных препаратов [6][12]. Так, в последние годы были проведены исследования по терапии ИЦ с использованием моноклональных антител [23] селективного ингибитора хемокиновых рецепторов СХС 1/2 [13], стромальной васкулярной фракции жировых тканей человека [24], аутоплазмы, обогащённой тромбоцитами [12][25][26], гиалуроновой кислоты и хондроитин сульфата [27], и другие. Большинство из этих исследований было проведено на модели циклофосфамидного цистита, которая считается наиболее адекватной ИЦ человека.

В настоящем исследовании были показаны уменьшение толщины уротелия, его эрозии, резкий отёк и клеточная воспалительная инфильтрация слизистой и детрузора в ответ на введение в организм крыс циклофосфамида. Клиническая реакция животных в ответ на это сопровождалась развитием признаков боли, дистресса, поллакиурии, в ряде случаев гематурии.

Внутридетрузорное введение Ботокса® и Неоваскулгена® в виде монотерапии понижало частоту мочеиспускания и внутрипузырное давление в сравнении с течением циклофосфамидного ИЦ без лечения. Имело место и снижение остроты воспалительной реакции стенки мочевого пузыря при внутридетрузорном введении Неоваскулгена® в сравнении с аналогичным исследованием Ботокса®.

Позитивный эффект отмечен при эскалации дозы Неоваскулгена® при совместном воздействии Неоваскулгена® и Ботокса®, однако синергического эффекта не отмечено.

Наше исследование имеет ограничения, связанные с четвероногостью крысы, иной тазовой анатомией и функцией тазовых органов, проведением цистометрических исследований под анестезией. Кроме того, экспериментальный циклофосфамидный цистит воспроизводится химическим агентом, а ИЦ человека — это хроническое заболевание неясной причины. Поэтому результаты нашего исследования следует с осторожностью экстраполировать на человека.

Заключение

Проведённое исследование подтвердило, что циклофосфамид вызывает цистит у крыс, симптомы и признаки которого подобны ИЦ человека. Внутридетрузорное введение препарата Неоваскулген® самкам крыс, обработанных циклофосфамидом, вызывает редукцию симптомов, улучшает функцию мочевого пузыря и снижает активность воспалительной реакции в стенке органа. Эффекты Неоваскулгена® подобны действию Ботокса® в модели циклофосфамид-индуцированного интерстициального цистита.