Молекулярно-генетические подтипы немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря и их влияние на прогноз заболевания

Введение

Рак мочевого пузыря (РМП) входит в первую десятку по встречаемости (9,5 и 2,4 случая на 100 000 мужчин и женщин соответственно, варьируясь в разных регионах мира в зависимости от факторов риска, качества и доступности медицинского сопровождения). Смертность от данного заболевания достигает 3,3 и 0,86 случая на 100 000 мужчин и женщин соответственно [1]. При первичной диагностике бо́льшая доля (75%) выявленного РМП является поверхностным — немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (НМИРМП) [1][2]. Известно, что результаты лечения НМИРМП значительно превосходят аналогичные при лечении мышечно-инвазивных форм (МИРМП) по летальности и количеству осложнений, однако частые рецидивы ухудшают качество жизни пациентов и требуют больших ресурсов системы здравоохранения [1][3][4]. В настоящее время многие учёные продолжают процесс совершенствования методов диагностики и лечения НМИРМП для предотвращения прогрессии заболевания и улучшения результатов лечения. С накоплением знаний и анализом методов лечения стало очевидным, что для значительного прогресса в борьбе с НМИРМП необходим учёт молекулярно-генетических особенностей как мышечно-инвазивных, так и немышечно-инвазивных форм РМП [5]. В данном исследовании мы провели анализ молекулярно-генетических форм НМИРМП и изучили их влияние на прогноз заболевания.

Цель исследования: оценить влияние молекулярно-генетических подтипов немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря на прогноз заболевания и целесо­образность их внедрения в рутинную клиническую практику.

Материалы и методы

В исследование включены 162 пациента (122 (75,3%) мужчин и 40 (24,7%) женщин) с впервые выявленным НМИРМП, которым с 2011 по 2021 год в университетской клинике урологии была выполнена трансуретральная резекция (ТУР) мочевого пузыря.

Критериями включения являлись наличие первичного НМИРМП, согласие на участие в исследовании и наблюдение > 2 лет с проведением контрольных обследований. Критериями исключения являлись наличие сопутствующей карциномы in situ, отказ от участия в исследовании, невозможность контакта с пациентом, отсутствие контроля отдалённых результатов, отсутствие данных о проведённых цистоскопиях, МРТ или УЗИ мочевого пузыря.

При en-bloc ТУР применяли как лазерную энергию, так и энергию биполярного электротока, тогда как при стандартной ТУР применяли лишь биполярный электроток. В послеоперационном периоде, согласно клиническим рекомендациям, в 71% случаев после ТУР была проведена адъювантная внутрипузырная химиотерапия (ВПХТ). В случаях, когда проведение ВПХТ представлялось невозможным или пациенты отказывались от неё, через уретральный катетер подключали систему непрерывного орошения мочевого пузыря (СНОМП) на 24 часа.

Послеоперационное наблюдение представляло собой выполнение цистоскопий (при невозможности проведения цистоскопии или отказе пациентов от неё — МРТ мочевого пузыря или УЗИ мочевого пузыря) раз в 3 месяца на протяжении первого года после оперативного вмешательства, раз в 6 месяцев — на протяжении второго года после оперативного вмешательства и раз в год — начиная с третьего года после операционного вмешательства при отсутствии рецидивирования и / или прогрессии. При подозрении на рецидивирование и / или прогрессию заболевания производили ТУР с последующей гистологической оценкой полученного препарата.

После стандартного патогистологического исследования послеоперационного материала для определения молекулярно-генетических подтипов было проведено иммуногистохимическое исследование (ИГХ-исследование).

Иммуногистохимическое исследование. Биоптаты опухолевой ткани мочевого пузыря фиксировали в 10%-м нейтральном (забуференном) формалине в течение 24 часов. Далее материал обрабатывали по стандартной методике и заливали в парафин. Срезы с парафиновых блоков толщиной 5 мкм наносили на стёкла с адгезивным покрытием PCI (Citotest Labware Co., Ltd, Haimen, Jiangsu, China). Препараты окрашивали антителами к маркерным белкам CK5/6 и GATA3, а также к белку FOXA1 при помощи иммуностейнера BenchMark XT ("Ventana Medical Systems, Inc.", Tucson, AZ, USA / Roche, Basel, Switzerland) с использованием стандартных протоколов (температура инкубации 37 градусов, время инкубации 20 минут), панели детекции DAB Universal ultraView (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ, USA / Roche, Basel, Switzerland) и первичных моноклональных антител, указанных в таблице 1. На начальном этапе исследования проводили отработку титров для антител к GATA3 и FOXA1. Оптимальные титры, использованные в дальнейшем при анализе опухолевых образцов, приведены в таблице 1.

Люминальный молекулярный подтип характеризовался позитивным ядерным окрашиванием с GATA3, негативной реакцией с СК5/6 и реакцией с FOXA1 равной 8 баллам. Люминально-подобный молекулярный подтип демонстрировал одновременно позитивное ядерное окрашивание с GATA3 и позитивное цитоплазматическое окрашивание с СК5/6 или негативное ядерное окрашивание с GATA3 и негативное цитоплазматическое окрашивание с СК5/6 и реакцию с FOXA1, равную 5 – 8 баллам. Промежуточный молекулярный подтип — одновременно позитивное ядерное окрашивание с GATA3 и позитивное цитоплазматическое окрашивание с СК5/6 или негативное ядерное окрашивание с GATA3 и негативное цитоплазматическое окрашивание с СК5/6 и реакцию с FOXA1, равную 0 – 4 баллам. Базально-плоскоклеточно-подобный молекулярный подтип имел позитивное цитоплазматическое окрашивание с СК5/6 и негативную реакцию с GATA3 и с FOXA1.

Статистический анализ. Статистический анализ и обработку полученных данных осуществляли с помощью электронных таблиц Microsoft Office Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) для Mac ver.16.76 и пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics ver. 26.0 (SPSS: An IBM Company, IBM SPSS Corp., Armonk, NY, USA), StatTech ver. 4.8.0 (ООО «Статтех», Россия). Нормальность распределения определяли с помощью теста Колмогорова-Смирнова-Lilliefors. Количественные данные описывались с помощью медианы (Me, нижнего и верхнего квартилей [ IQR — Q1; Q3] — в тексте представлено как Ме [IQR]. Категориальные данные описывались с указанием абсолютных значений (n) и процентных долей (%). При отсутствии нормального распределения данных использовали методы непараметрической статистики (U критерий Mann-Whitney). Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод Pearsons’ χ2 с поправкой Yates на непрерывность. Статистически значимыми считали различия при р <0,05 (95% уровень значимости).

Для изучения длительности безрецидивной выживаемости, выживаемости без прогрессии больных НМИРМП после ТУР мочевого пузыря был применён анализ по Kaplan-Meier. Для выявления значимости клинических параметров и результатов лечения в рецидивировании и прогрессии заболевания проведён однофакторный и многофакторный анализ.

Для разработки прогностической модели рецидива НМИРМП на основе молекулярно-генетических факторов проводили анализ влияния факторов на выживаемость (возникновение рецидива с учётом времени) по Kaplan-Meier с оценкой функции выживаемости и расчётом лог-рангового теста. Далее проводили моделирование зависимости вероятности наступления рецидива от статистически значимо влияющих факторов риска. Использовали две математические модели: модель логистической регрессии (логит-модель) и модель регрессии Cox, учитывающей время наступление рецидива. Наилучший прогностический результат показала модель логистической регрессии. Модель строили пошаговым методом включения переменных на основе изменения критерия правдоподобия модели.

Поскольку значения всех факторов (независимые переменные) в модели логистической регрессии были сгруппированы, производили кодировку параметров полученной модели логистической регрессии и рассчитывали коэффициенты для каждой из них. Таким образом, было получено уравнение для вероятности наступления рецидива.

На основе полученного уравнения построена прогностическая модель и написана программа: модель прогнозирования риска рецидивирования на основе молекулярно-генетических факторов. Программа содержит код на языке синтаксиса IBM SPSS Statistics для расчётов полученной модели, исходную выборку для обучения и калькулятор скоринга пациентов в MS Excel на основе построенной модели. Тип ЭВМ: ПК Язык: Синтаксис IBM SPSS Statistics 26.0, MS Excel ОС: Windows 7\8\10\11.

Результаты

Медиана возраста пациентов составила 67,00 [ 59,00; 72,00] лет. Интраоперационные показатели и подробные результаты лечения представлены в таблице 2.

По результатам патологоанатомического исследования у 94 (58%) выявлена стадия Ta, у 68 (42%) — Т1. Низкая степень злокачественности определена у 122 (75,3%) пациентов, высокая — у 40 (24,7%). Мышечный слой был представлен в 147 (90,7%) препаратах.

По результатам лечения пациенты разделены на 4 группы риска по прогностической модели европейской организации исследования и лечения рака / European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) 2006 года. Среди 162 пациентов 87 (53,7%) имели низкий риск рецидива и прогрессии заболевания, 43 (26,5%) пациента — средний риск, 25 (15,4%) — высокий риск, а 7 (4,3%) — очень высокий риск.

По результатам ИГХ-исследования пациенты разделены на 4 группы: пациенты с люминальными опухолями — 96 (59,3%), пациенты с люминально-подобными опухолями — 51 (31,5%), пациенты с промежуточными опухолями — 5 (3,1%) и пациенты с базально-плоскоклеточно-подобными опухолями — 10 (6,2%).

Медиана сроков послеоперационного наблюдения составила 60 месяцев. Рецидив заболевания в течение 3 лет выявлен у 74 (45,7%) пациентов, а прогрессия — у 11 (6,8%) пациентов.

На количество рецидивов статистически значимого влияния не оказывали такие факторы, как пол пациентов, время операции, наличие послеоперационных осложнений по Clavien, размер опухолей, проведение ВПХТ или налаживание СНОМП, наличие мышечного слоя в послеоперационном препарате (p > 0,05).

На количество прогрессий статистически значимого влияния не оказывали такие факторы, как пол пациентов, их средний возраст, время операции, наличие после­операционных осложнений по Clavien, вид оперативного вмешательства, применяемая энергия при оперативном вмешательстве, количество опухолей, размер опухолей, проведение ВПХТ или налаживание СНОМП, наличие мышечного слоя в послеоперационном препарате, Т-стадия заболевания, степень злокачественности опухолей и группа риска по прогностической модели EORTC-2006 (p > 0,05).

В таблице 3 продемонстрированы факторы, статистически значимо влияющие на развитие рецидива заболевания. Кривая безрецидивной выживаемости продемонстрирована на рисунке 1.

Средний возраст пациентов без рецидива был ниже. Также снижали вероятность рецидива en-bloc ТУР и выполнение оперативного вмешательства с помощью лазерной энергии. Среднее количество опухолей было одинаковым у пациентов с рецидивом и без, однако разброс данных был выше у пациентов с рецидивом. Стадия заболевания и степень злокачественности опухоли также являлись предиктором рецидива (в группе пациентов с рецидивом преобладали пациенты со стадией Т1 и с высокой степенью злокачественности).

Прогностическая модель EORTC-2006, как и молекулярно-генетический подтипы РМП имели значимую прогностическую ценность. В группе пациентов с рецидивом больше пациентов со средним, высоким и очень высоким риском рецидивирования, а также пациентов с опухолями промежуточного, базально-плоскоклеточно-подобного и люминально-подобного типов. Таким образом, одну из ключевых ролей в прогнозировании рецидива заболевания играет молекулярно-генетический подтип РМП.

Молекулярно-генетические подтипы НМИРМП также играют ведущую роль в прогнозировании прогрессии (p < 0,001), как указано на рисунке 2: у пациентов с промежуточным и базально-плоскоклеточно-подобным подтипами заметно ниже выживаемость без прогрессии.

По результатам многофакторного анализа также подтверждено значение молекулярно-генетических факторов на течение заболевания. В таблице 4 показаны значимые факторы, влияющие на рецидивирование и прогрессирование заболевания.

Для разработки прогностической модели использовали факторы, которые после анализа обладали достаточной прогностической ценностью. В итоговое уравнение логистической регрессии вошли такие факторы, как молекулярный подтип, возраст, морфологическая стадия, количество опухолей. Уравнение оказалось статистически значимым со всеми коэффициентами логистической регрессии на уровне p < 0,05.

При люминально-подобном молекулярном типе риск рецидива в среднем в 2,9 раза выше, чем при люминальном. При промежуточном или базально-плоскоклеточном типе риск выше в 37,2 раза по сравнению с люминальным типом. Пациенты в возрасте старше 67 лет имеют соотношение шансов рецидива по сравнению с группой до 67 лет включительно в 2,1 раза выше. При количестве опухолей от 2 и более шанс рецидива увеличивается в 2,5 раза. При морфологической стадии T1 соотношение шансов рецидива составляет 2,8 по сравнению с теми, у кого стадия Ta.

Уравнение для вероятности наступления рецидива можно записать формулой:

где,

Z_i=1,074*X_{1_2}+3,617*X_{1_3}+0,756*X_{2_2}+0,906*X_{3_3}+1,037*X_{4_2};

X_{i_j} – значения исходных независимых переменных.

Данное уравнение регрессии при пороге отсечения вероятности 0,5 предсказывает 77,3% наступивших рецидивов (чувствительность модели) и 60,8% ненаступивших рецидивов (специфичность модели), при этом общая прогностическая способность модели удовлетворительная и составляет около 70,0%.

После построения логистической регрессии для анализа качества её классификации и общей прогностической силы был проведён ROC-анализ и проанализирована площадь под ROC-кривой. Также для сравнения брали прогноз по EORTC-2006 (рис. 3).

Площадь под кривой AUC для полученной модели составила 0,774 c 95% ДИ от 0,702 до 0,845, что соответствует хорошему качеству построенной прогностической модели. Для прогноза по EORTC-2026 площадь под кривой AUC равна 0,643 с 95% ДИ от 0,557 до 0,728.

Обсуждение

Лечение НМИРМП представляет собой длительный процесс, включающий оперативное вмешательство и последующее лечение и наблюдение, зависящий от качества медицинской помощи и результатов патологоанатомического исследования послеоперационного материала [1][6][7].

По нашим данным, пол пациентов, время операции, наличие послеоперационных осложнений по Clavien, размер опухолей, проведение ВПХТ или налаживание СНОМП, наличие мышечного слоя в послеоперационном препарате не имели значимого влияния на развитие рецидивов и прогрессирование заболевания (p > 0,05). По нашему мнению, нивелирование данных факторов связано с усовершенствованием протоколов лечения.

С течением времени и накоплением знаний стало очевидно, что одним из значимых факторов, влияющих на течение заболевания, являются молекулярно-генетические особенности НМИРМП [1][5]. В нашем исследовании с целью масштабирования и внедрения в широкую клиническую практику молекулярно-генетического типирования НМИРМП выполнено ИГХ-исследование для определения его подтипов. Как видно из работы французских коллег, данный метод является достаточно точным и позволяет классифицировать РМП без необходимости выполнения дорогостоящих генетических исследований [5][8].

Необходимо отметить, что ранее были проведены работы, посвящённые изучению молекулярно-генетических особенностей, НМИРМП и разработана классификация. Так, G. Sjödahl et al. (2012) после изучения экспрессии белков на поверхности опухолевых клеток и изучения их генотипа и мутаций разделили все опухоли на 7 кластеров и 5 подтипов: уробазальный А (кластеры MS1a и MS1b), геномно-нестабильный (кластеры MS2a1и MS2a2), уробазальный В (кластер MS2b2.1), плоскоклеточно-подобный (кластер MS2b2.2) и инфильтративный (кластер MS2b1) [9].

Ещё одной комплексной работой по изу­чению молекулярно-генетических особенностей НМИРМП является исследование S.V. Lindskrog et al. (2021). Авторы провели генетический, протеомный, транскриптомный анализы, анализ мутаций, микроокружения опухоли, экспрессируемых на поверхности клеток белков. Авторы выделили 3 класса по результатам комплексного изучения опухолевых образцов: 1, 2а, 2b и 3 классы [10].

Результаты, полученные нами и коллегами, оказались тождественными (табл. 5).

В отношении молекулярно-генетических подтипов и их влияния на лечение и прогноз заболевания также достигнут консенсус по молекулярно-генетическим подтипам МИРМП, который является одним из самых фундаментальных трудов современности в изучении РМП. Согласно консенсусу, существует 6 подтипов МИРМП (люминальный папиллярный, люминальный неспецифический, люминальный нестабильный, стромальный, базальный / плоскоклеточный и нейроэндокриноподобный), обладающих различными генетическими и мутационными особенностями, различным профилем экспрессии антигенов, микроокружением опухолей, прогнозом заболевания и ответом на лечение [5][11].

Таким образом, молекулярно-генети­ческие подтипы НМИРМП обладают значительным влиянием на прогноз заболевания, являясь предиктором как рецидива заболевания, так и прогрессии. Разработанная нами прогностическая модель и программа ЭВМ для расчёта риска рецидива на основе молекулярно-генетических подтипов НМИРМП превосходит по чувствительности и специфичности прогностическую модель EORTC 2006 года. Наши результаты не противоречат мировым данным и соответствуют выводам коллег, изу­чающих данную проблематику: большая часть НМИРМП является люминальной или имеет признаки люминальных опухолей и обладает лучшим прогнозом, тогда как небольшая часть является базально-плоскоклеточно-подобной с неблагоприятным прогнозом. Небольшая часть опухолей, названных нами промежуточными, по результатам ИГХ-исследования не могла быть отнесена к остальным подтипам. Мы полагаем, что дальнейшее исследование генетического материала и профиля мутаций сможет распределить промежуточный и люминально-подобный подтипы в другие категории или подтвердить их непринадлежность к остальным подтипам.

Заключение

ИГХ-исследование образцов ткани после ТУР мочевого пузыря у пациентов с НМИРМП и его классификация по молекулярно-генетическим подтипам может существенно улучшить прогнозирование рисков рецидивирования и прогрессии заболевания. Учёт молекулярно-генетических подтипов для планирования дальнейшей тактики лечения и мониторинга является необходимым для улучшения прогноза и перехода к персонифицированной медицине.

Необходимы дальнейшие исследования, организация консенсуса аналогичного консенсусу по МИРМП, для широкого внедрения в клиническую практику молекулярно-генетической классификации НМИРМП.