Взаимосвязь микробиома и мастоцитоза тестикулярной ткани при азооспермии

Введение

Мужское бесплодие приобретает важное социальное значение и становится все более серьёзной медицинской проблемой, хотя механизм его возникновения остаётся плохо изученным. В последние годы наблюдается растущий интерес к пониманию причин и методов лечения мужского бесплодия [1][2].

Репродукция, как известно — сложный процесс, в основе которого лежит взаимодействие эндокринной и иммунной систем и микробиоты. Тестикулярный иммунитет характеризуется так называемой иммунной привилегией, механизмом, который позволяет избежать аутоиммунных атак против белков, экспрессируемых сперматозоидами [3]. В то же время, тестикулярная ткань обладает эффективным локальным врождённым и адаптивным иммунитетом [4][5]. Тучные клетки (мастоциты) являются одной из наиболее значимых популяций иммунных клеток в яичках [6]. Они вносят свой вклад в иммунную привилегию яичка и гомеостаз, который они поддерживают [7] благодаря своей общей роли в регуляции проницаемости сосудов и иммуномодуляции, а также предположительно и в сперматогенезе [8]. В последнее время обсуждается вопрос об участии тучных клеток в неконтролируемых воспалительных реакциях при различных клинических состояниях [9]. Например, мастоциты накапливаются в атеросклеротических бляшках и, вероятно, играют решающую роль в развитии инфаркта и инсульта [10]. Показано участие тучных клеток в патогенезе эндометриоза, болезни Crohn и воспалительных заболеваний кишечника, а также в развитии лёгочного и печёночного фиброза [11][12] Специфические пути регуляции тучных клеток при тестикулярных поражениях остаются невыясненными. Вместе с тем, считается, что в яичках человека увеличение количества интерстициальных мастоцитов приводит к нарушению сперматогенеза [13][14] и, возможно, к мужскому бесплодию [15].

Наряду с этим, изучение таксономической структуры микробиома тестикулярной ткани является одной из самых динамичных областей исследования нашего времени, особенно после усовершенствования в технологии сбора и анализа данных о последовательностях ДНК [16]. Методы секвенирования нового поколения (next-gen sequencing —NGS) предоставили возможность оценки микробных сообществ различных органов и тканей. В настоящее время публикуется всё больше исследований о связи между микроорганизмами и мужским бесплодием, однако микробиом тестикулярной ткани изучен недостаточно в сравнении с другими системами и органами. Сложность мужского бесплодия привела к пониманию того, что интегрированный многокомпонентный анализ может быть оптимальным для выявления этого заболевания [17].

Цель исследования: провести анализ таксономической структуры микробиома тестикулярной ткани и урогенитального тракта мужчин с азооспермией и исследовать связь между микробиомом тестикулярной ткани и мастоцитами в паренхиме яичка.

Материалы и методы

Материалом исследования послужили образцы тестикулярной ткани инфертильных пациентов с азооспермией (n = 33) в возрасте от 23 до 74 лет.

После обследования общесоматического статуса и основной патологии каждому пациенту была выполнена TESE с забором биоптата в период с 2018 по 2021 годы. Пациенты были распределены на две группы в зависимости от формы азооспермии: группа 1 (n = 21) — инфертильные пациенты с необструктивной азооспермией (НОА); группа 2 (n = 12) — инфертильные пациенты с обструктивной азооспермией (ОА).

Полученный материал был отправлен на рутинное патогистологическое исследование. При проведении гистологического анализа важным этапом микроскопического изучения биоптата яичка являлась оценка степени нарушений сперматогенеза по Шкале D. De Kretser и A. Holstein, что подтверждало диагностику азооспермии различного генеза. Помимо оценки состояния семенных канальцев, большое внимание было обращено к межканальцевой структуре паренхимы яичка (приоритет изобретения 2023117159, от 29.06.2023 года «Способ прогнозирования идиопатического мужского бесплодия в условиях программ вспомогательных репродуктивных технологий»). Оценивали состояние микроциркуляторного русла и соотношение клеток Leydig, фибробластов, макрофагов и мастоцитов. Для определения ИГХ-экспрессии маркёров мастоцитов использовали иммуногистохимическую окраску с анти-MCT (Anti-Mast Cell Tryptase).

Для исследования структуры микробиома тестикулярной ткани был проведён анализ ампликонов бактериального гена 16S pРНК с использованием высокопроизводительного NGS [приоритет изобретения 2022121553, от 08.08.2022 года «Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин»]. Также для генетического исследования бактериального спектра урогенитального тракта и контроля чистоты метода был произведён забор биологического материала из уретры у каждого пациента, которому проводили биопсию яичка. Данные обрабатывали с помощью программы QIIME ver. 1.9.1 (“Caporaso Lab”, Northern Arizona University, Flagstaff, AZ, USA).

Для оценки регуляции процесса сперматогенеза и функций клеток Sertoli в крови пациентов определяли концентрацию гормонов: фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, ингибин В и тестостерон.

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных данных выполняли в программной среде R (“The R Foundation for Statistical Computing”, Vienna, Austria, https://www.r-project.org/). Нормальность распределения определяли с помощью теста Shapiro-Wilk. Корреляционный анализ был проведён с использованием коэффициента Spearman. Значение p < 0,05 было принято как статистически значимое.

Результаты

Средний возраст пациентов (М ± SD) составил 39,4 ± 10,7 лет, средняя продолжительность бесплодного брака — 7,2 ± 7,8 лет.

Нами обнаружено, что микробиом пациентов с НОА заметно отличается от микробиома пациентов с ОА (р < 0,05). А именно, в группе 1 достоверно чаще обнаруживаются представители семейств Enterobacteriaceae и Xanthomonadaceae, родов Finegoldia, Bifidobacterium, Porphiromonas, Prevotella, Peptoniphilus и Pseudomonas (рис. 1).

Анализ уровня гормонов показал снижение концентрации тестостерона и увеличение ФСГ и ЛГ у пациентов группы 1. При этом установлена отрицательная корреляционная связь между уровнем Ингибина В и уровнями ФСГ и ЛГ у пациентов группы 1 (r = -0,678; p < 0,05; r = -0,645; p < 0,05) и в тестикулярной ткани и в уретре. Также обращает на себя внимание тот факт, что чем выше ФСГ и ЛГ у пациентов с НОА, тем меньшее количество таксонов обнаруживается в уретре (r = -0,485; p < 0,05) (рис. 2).

В группе 2 также чаще встречались представители семейства Enterobacteriaceae, родов Finegoldia, Peptoniphilus и Pseudomonas (рис. 1). Отличительной особенностью пациентов с ОА является редкое обнаружение рода Prevotella. Общее же количество обнаруженных таксонов в группе 2 достоверно ниже (р < 0,05), чем в группе пациентов с НОА (рис. 3).

Обращает на себя внимание тот факт, что количество таксономических групп в уретре значительно ниже, чем в яичках в обоих группах. При этом выявлена отрицательная корреляционная связь индекса альфа-разнообразия Shannon (r = 0,591; p < 0,05) и индекса Simpson (r = 0,680; p < 0,05) с количеством мастоцитов в строме в группе с ОА.

При проведении гистологического анализа отмечено утолщение интимы и склероз наружной оболочки кровеносных сосудов, который свидетельствовал об артериосклерозе. Кроме того, выявлены повреждения и дегенерация клеток Leydig, которые часто сопутствуют нарушениям сперматогенеза. Гистопатологический анализ выявил положительную ИГХ-реакцию на триптазу мастоцитов (анти-МСТ), которая проявлялась окрашиванием в виде гранулированного цитоплазматического узора, ограниченного тучными клетками (некоторые из них — с дегрануляцией).

В результате у пациентов с азооспермией и с бедной палитрой микробного спектра было отмечено большое количество мастоцитов в межканальцевой строме практически в 83 % случаев.

В свою очередь мастоциты в канальцевых структурах при азооспермии встречаются в 68% случаев и коррелируют с микробиомом. Так, например, в группе НОА выявлена высокая положительная корреляционная связь с Bifidobacterium (r = 0,710; p < 0,05) и Dermabacter (r = 0,527; p < 0,05), в то время как в группе ОА выявлена положительная корреляция с: Cloacibacterium (r = 0,961; p < 0,05), Propionibacterium (r = 0,665; p < 0,05), Collinsella (r = 0,665; p < 0,05), Porphyromonas (r = 0,647; p < 0,05), Staphylococcaceae (r = 0,632; p < 0,05). Полное отсутствие мастоцитов выявлено лишь у 32% пациентов.

Обсуждение

Локальное увеличение количества тучных клеток в корреляции с нарушениями микробного сообщества может быть важным фактором, приводящим к необратимым изменениям в тестикулярной ткани и бесплодию у мужчин. Таким образом, представить развитие азооспермии можно в виде порочного круга, началом которого является инфекционный агент (рис. 5).

Несмотря на мощный иммунный арсенал мужских гонад и наличие собственной микробиоты, поражение яичка возможно патогенами из уретры, а также патогенной флорой, передающейся половым путём [18]. Под воздействием инфекционного агента происходит нарушение целостности гематотестикулярного барьера и активация локального иммунного ответа с синтезом и продукцией медиаторов воспаления [19]. В свою очередь эти события приводят к изменению уникального микробного ландшафта урогенитального тракта и гонад.

В этом исследовании мы изучили таксономическую структуру микробиома тестикулярной ткани и уретры пациентов с обструктивной и необструктивной азооспермией, а также взаимосвязь между количеством мастоцитов и микробиомом. При биопсии яичек у пациентов с азооспермией достоверно чаще обнаруживаются представители Enterobacteriaceae и Xanthomonadaceae семейств, родов Finegoldia, Bifidobacterium, Porphiromonas, Prevotella, Peptoniphilus и Pseudomonas. Как известно из данных литературы, Lactobacillus, Pseudomonas и Prevotella представляют собой основные бактерии, содержащиеся в семенной жидкости. Однако обилие Prevotella снижает численность Lactobacillus, а также отрицательно коррелирует с концентрацией сперматозоидов [20], а большое количество Pseudomonas напрямую связано с общим количеством подвижных сперматозоидов [21]. В нашем исследовании представители рода Prevotella у пациентов с НОА встречаются в большом количестве, а у пациентов с ОА — в очень малых, вплоть до полного отсутствия. По данным литературы, умеренное количество Lactobacillus, Pseudomonas, Streptococcus, Gardnerella и в том числе Prevotella обнаруживаются в образцах семенной жидкости здоровых мужчин [22].

Также нарушение целостности гематотестикулярного барьера приводит к увеличению количества тучных клеток в соединительной ткани с последующим нарушением таксономической структуры микробиоты тестикул [23]. Известно, что мастоциты широко распространены в соединительных тканях, могут участвовать как в острых, так и хронических воспалительных реакциях. А триптаза, вырабатываемая мастоцитами, вызывает пролиферацию фибробластов и синтез коллагена, что приводит к фиброзу и склерозу тканей [6][24]. При проведении корреляционного анализа у пациентов с азооспермией и с бедной палитрой микробного спектра было отмечено, что значительно больше мастоцитов в строме обнаруживается у пациентов в группе 2 (р < 0,05). И чем больше количество мастоцитов в строме обнаруживается у пациентов с ОА, тем у них меньше разнообразие микробиома уретры.

Заключение

Комплексный подход к диагностике мужского бесплодия закладывает основу для изучения причинно-следственной связи микробиома и иммунного ответа в естественных условиях, включая изменения количества и типов иммунных клеток. В этом плане исследование показало, что повреждения, вызванные мастоцитами в строме и канальцах, взаимосвязаны с таксономической структурой микробиома тестикулярной ткани. Кроме того, яички пациентов с НОА имеют качественно и количественно более разнообразный спектр как на уровне семейств, так и родов в отличие от пациентов с ОА. Дальнейшие исследования в этом направлении могут рассмотреть не только новые критерии диагностики азооспермии, но также обеспечить более целенаправленную иммунную таргетную терапию, возможно комбинированную иммунотерапию с терапией препаратами микрофлоры, что может быть более эффективным при лечении мужского бесплодия.