Морфогенез пенильного кавернозного фиброза при гипотестостеронемии в экспериментальной модели

Введение

Эректильная дисфункция (ЭД) — много­факторное (полиэтиологическое) состо­яние, представляющее собой неспособ­ность достижения или поддержания эрекции, достаточной для проведения полового акта [1]. В зарубежных и отечественных научных базах данных содержится множество исследований по изучению этиологических факторов ЭД и патоге­нетических механизмов, таких как атеросклероз и артериальная гипертензия, приводящих к не­достаточности артериального притока крови, а также синдром ускоренного венозного сброса в ответ на пролонгированную внутрикавернозную гипертензию, приводящих к функциональным и органическим изменениям в половом члене. Фундаментальными работами по изучению мно­гофакторности ЭД являются экспериментальные исследования на моделях животных [2], именно результаты изучения молекулярно-биохимиче­ских реакций и патогистологических проявлений являются релевантными при условии возможно­сти их воспроизводимости, чего почти невозмож­но достичь в рамках клинических исследований.

Первая значимая фундаментальная работа по изучению физиологии эрекции была проведе­на G.R. Fournier et al. в 1987 году, которые проде­монстрировали на собаках работу вено-окклюзионного механизма. Авторы предположили, что снижение эластичности кавернозных синусов вследствие альтерации гладкомышечных клеток, является причиной повреждения эректильных реакций [3]. В будущем эта гипотеза была под­тверждена дальнейшими исследованиями на ла­бораторных животных [4, 5].

За более чем 30 лет научных работ в области экспериментального моделирования ЭД сфор­мировался концептуальный подход к исполь­зованию в качестве моделей воспроизведения ЭД четырёх наиболее значимых этиологических факторов - старение, повреждение кавернозных нервов, сахарный диабет и гипогонадизм [6]. Наибольший интерес, на наш взгляд, представ­ляет в настоящее время кастрационная гипотестостеронемическая модель. Практичность её использования в динамике развития патологических проявлений, относительная простота индук­ционной манипуляции и отсутствие необходи­мости применения химических препаратов или узкоспециализированной аппаратуры делает её привлекательной с целью познания патофизио­логии ЭД [7-9].

Тестостерон (Т), так или иначе, задействован в нарушении каскада биохимических реакций при всех вышеперечисленных этиологических факто­рах. При снижении его уровня в системном кро­вотоке в эндотелии сосудов, в частности пениль­ных, нарушается синтез NO из аргинина из-за дисрегуляции NO-синтазы, что запускает цепную патологическую реакцию с участием цГМФ, при­водящую к дисфункции гладкомышечных клеток (ГМК). Это, в свою очередь, является причиной нарушения вазомоции, ишемизации каверноз­ных тел пениса, активации TGF-β и накопления коллагеновых волокон в них [10-13].

Эти патобиохимические реакции были описа­ны на основании результатов экспериментальных работ, однако вопрос о влиянии тех или иных сиг­нальных путей на каскад основных молекулярных взаимодействий остаётся дебатируемым [14, 15]. В дополнение к этому отсутствует понимание этапности мофологических проявлений фиброгенеза кавернозных тел - в большинстве работ, в рамках которых апробируются новые методы профилакти­ки или лечения ЭД в условиях экспериментальных моделей, выбор временных рамок воздействия на пенис не обоснован и отличен у разных авторов [16, 17]. Это в свою очередь свидетельствует об от­сутствии валидности получаемых результатов, по­скольку эффективность того или иного метода ле­чения будет различна в зависимости от исходной степени фиброза кавернозных тел.

Таким образом, для определения оптимальных временных параметров лечебного воздействия на пенис необходимо проведение эксперименталь­ного исследования с детальной оценкой морфо­логических проявлений пенильного кавернозного фиброза в единых стандартизированных условиях, что обеспечит репрезентативность получаемых ре­зультатов.

Цель исследования: определить особенности морфологических альтераций и выраженность фиброгенного патологического процесса в кавер­нозных телах пениса во временной динамике экс­периментального моделирования гипотестостеронемии.

Материалы и методы

Лабораторные животные (ЛЖ)

В качестве объекта для экспериментального исследования использовано 20 белых кроликов самцов породы «New Zealand» рода Oryctolagus cuniculus массой 3,8±0,3 кг и возрастом 26 ±1,5 нед. ЛЖ содержались в условиях, отвечающих ги­гиеническим и санитарно-эпидемиологическим нормам согласно ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными жи­вотными. Правила оборудования помещений и организации процедур» и ГОСТ 33216 - 2014 «Ру­ководство по содержанию и уходу за лаборатор­ными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» [18, 19]. Срок адаптации ЛЖ перед началом исследо­вания в изоляционной зоне составил 28 дней.

В ходе исследования животные ежедневно проходили ветеринарное обследование на пред­мет наличия заболеваний и болевого синдрома, вивисекция и эвтаназия животных не произво­дилась, что соответствует положениям, статьям и требованиям международных и отечественных документов и руководств (согласно рекоменда­циям Rus-LASA) [20-22].

Дизайн исследования

Разработка дизайна исследования прове­дена в соответствии с рекомендациями ARRIVE; экспериментальные данные описаны согласно чек-листу проверки качества экспериментальных исследований [23, 24].

На первые сутки экспериментального иссле­дования для моделирования гипотестостероне­мии каждому ЛЖ была проведена двухсторонняя орхиэктомия. Для обеспечения редуцирования ошибок отбора (selection bias), ухудшающих ка­чество проведения эксперимента, по истечению срока адаптации было произведено рандомное разделение ЛЖ на 4 группы по 5 особей в зави­симости от срока забора биоматериала на гисто­логический анализ: 1 группа - на 1 сутки экспе­римента, 2 группа - на 7 сутки эксперимента, 3 группа - на 14 сутки эксперимента и 4 группа - на 21 сутки эксперимента.

Уровень общего Т в системном кровотоке у ЛЖ определяли на 1, 2, 3, 14, 21 и 28 сутки при помощи гетерогенного (твёрдофазного) хемилю- минесцентного иммуноанализа согласно прото­колу ELISA (Multiskan Ex Primary LIA V. 2.3; Thermo, Vantaa, Finland). Статистическую обработку по­лученных данных проводили при помощи про­грамм Microsoft Exсel и «Statistica 10.0» с ис­пользованием Student's T-criteria. Статистически значимыми результатами было принято считать при уровне значимости p<0,05.

Анестезиологическое пособие при прове­дении хирургических мероприятий состояло из премедикации, индукции анестезии и саппорт- анестезии. В качестве методов премедикации применяли преоксигенацию в течение 20 минут, маропитант (2 мг/кг п/к), габапентин (10 мг/кг per os) и капрофен (1 мг/кг п/к). Для индукции анестезии использовали медетомидин (0,2 мг/ кг в/м), фамотидин (0,5 мг/кг в/в), пропофол (2 мг/кг в/в) и золетил (0,4 мг/кг в/в), затем ЛЖ интубировали трубкой диаметром 2,5 мм. Для саппорт-анестезии использовали изофлюран 3% и дексмедетомидин в инфузии с постоянной ско­ростью 1 мкг/кг/ч.

Двустороннюю орхиэктомию выполняли стандартным открытым способом с удалением семенников и придатков [25]. Для проведения гистологического анализа состояния пенильных тканей в условиях гипотестостеронемии нами разработана и применена жизнесберегающая техника частичной ампутации пениса с нало­жением промежностной уретростомы кролику, что соответствует общемировой тенденции по гуманизации экспериментальной медицины. В статьях, опубликованных до 2020 года в между­народных базах данных The Cochrane Database, MEDLINE/PubMed Database, Embase-Elsevier, SciVerse Scopus, Web of Science Core Collection описаны результаты аналогичных исследований по изучению пенильной морфологии с вивисек­цией животных для забора биоматериала.

Этапы частичной пенектомии с момента соз­дания операционного поля (ЛЖ в положении лёжа на спине) и комплекса стандартных асепти­ческих мероприятий:

• анатомическим пинцетом дистальный ко­нец пениса отводили, приводя его в перпендику­лярное положение относительно тела;
• электрохирургическим скальпелем-коагу­лятором производили Т-образный разрез пре­пуция проксимальнее головки пениса по центру вентральной и дорсальной поверхности: на апи­кальном конце поперечный разрез соединяли циркулярно, продольный разрез продолжали до основания наружной части пениса;
• основания двух сформированных лоскутов обрезали циркулярно, формируя ложе будущей уретростомы диаметром 1,5-2 см;
• в пенис вводили полиуретановый уретраль­ный катетер с наружным диаметром 1,2 мм;
• прямыми тупоконечными ножницами про­водили разрез уретры в дорсальной части пениса по ходу катетера до базальной части;
• теми же ножницами пенис отсекали на уровне основания;
• ножки кавернозных тел электрокоаголирували, из них формировали подушки посредством наложения узловых швов викрилом 4/0, соединя­ющих раневые грани в поперечном направлении;
• формировали уретростому посредством соединения граней оставшейся части уретры к сформированному ранее ложу из кожи отдель­ными узловыми швами викрилом 4/0.

Послеоперационный уход за ЛЖ заключался в ежедневном уходе за уретростомой при помо­щи растворов хлоргексидина 0,05% и перекиси водорода 3% и марлевых тампонов с поступа­тельными движениями от центра к периферии для её очищения. Затем на стому наносили одну каплю вазелинового масла для профилактики её стенозирования и облитерации. В случае возник­новения стеноза проводили операцию по пере­формированию уретростомы.

На ампутированной части пениса выполняли 6 продольных тканевых анатомических срезов толщиной не более 5 мм по 3 с каждого кавер­нозного тела для морфологического анализа. Каждому участку биоматериала присваивали свой идентификационный номер для исключе­ния ошибок исследования.

Фрагменты тканей фиксировали в 10% ней­тральном забуференном формалине в течение 24 часов (BioVitrum, Россия) после чего выполня­ли проводку в гистологическом микроволновом процессоре Logos фирмы Milestone (Италия). По­сле заливки в парафин выполняли микротомию на микротомах Leica (Германия) толщиной срезов не более 3 мкм. Гистологические срезы окраши­вали гематоксилином-эозином, по Массону и Вейгерту. После окрасок полуколичественно из­учали соотношение клеток паренхимы и стро­мы в кавернозных телах (+ слабый признак, ++ умеренный признак, +++ выраженный признак). Нами был разработан алгоритм морфологиче­ского описания кавернозных тел с учётом лока­лизации и степени выраженности фиброза губ­чатого вещества, динамики изменений синусов, и ветвей улитковых артерий и артериол. Для детальной морфологической оценки состояния кавернозных структур использовали фотомикро­скоп Leica DM 1000 (Германия) с программным обеспечением Image Pro Plus, цифровой обра­боткой и математическим анализом фотографий.

Результаты

По результатам анализа сыворотки крови уровень общего Т статистически значимо сни­жался в первые сутки после кастрации и в даль­нейшем снижение Т продолжилось до 28 суток относительно исходного уровня (до орхиэктомии 10,8±0,2 нмоль/л), что свидетельствовало об эф­фективности моделирования гипотестостероне- мии у всех ЛЖ (рис. 1).

В условиях кастрационного уровня Т на 7 сутки эксперимента в центральных зонах кавер­нозных тел отмечено появление в межсинусных пространствах очагов разрастания рыхлой волок­нистой соединительной ткани, раздвигающих синусы и сдавливающих ГМК, такие же рыхлые волокнистые структуры начинают формировать­ся и вокруг артериол (рис. 2).

Уже на этом сроке исследования имеют ме­сто дистрофические и даже атрофические изме­нения ГМК (рис. 3).

Вместе с тем, в периферических, т.е. подбелочных отделах губчатого вещества наблюдается его нормальная структура (рис. 4).

К 14 дню эксперимента зоны разрастания рых­лой волокнистой соединительной ткани увеличи­вают свои размеры в центральной части кавер­нозных тел, и они же появляются в подбелочных пространствах. Некоторые участки рыхлой волок­нистой ткани трансформируются в плотную во­локнистую ткань, наиболее наглядно этот процесс обнаруживается вокруг мелких артериол, просвет которых вследствие этого деформируется и сужи­вается в центральных зонах (рис. 5), а в перифе­рических — пока ещё заметно компенсаторная гипертрофия ГМК (рис. 6). Имеет место и межу­точный умеренно выраженный отёк, как признак нарушения гемодинамики в кавернозных телах.

Через 4 недели гипотестостеронемии в ка­вернозных телах пениса определяются обшир­ные поля плотной волокнистой соединительной ткани, содержащие коллагеновые волокна, сдав­ливающие и деформирующие просветы синусов, улиткообразных артерий и артериол с их пере­стройкой и полнокровием (рис. 7).

Тяжёлый фиброз, состоящий из тонких и тол­стых коллагеновых волокон, сопровождается вы­раженной атрофией ГМК и значительной редук­цией синусов и кровеносных сосудов (рис. 8).

В центральных участках губчатого вещества имеет место гипоэластоз с извитостью и фраг­ментацией отдельных групп эластичных волокон (рис. 9).

Таким образом, морфологическое исследо­вание кавернозных тел после кастрации выявило определённые закономерности развития фибро­за в поверхностных и центральных отделах ка­вернозных тел пениса в динамике его развития.

Нами показано, что через 1 неделю после кастрации наибольшие изменения возникают в центральных отделах кавернозных тел, где име­ют место слабовыраженные дистрофические и атрофические изменения ГМК с неравномерным развитием вокруг них рыхлой волокнистой со­единительной ткани, содержащей тонкие колла­геновые волокна.

Через 2 недели после кастрации происходит формирование рыхлой и плотной волокнистой соединительной ткани как в поверхностных, так и в глубоких отделах кавернозных тел. Примеча­тельно, что фиброзная ткань «окутывает» крове­носные сосуды артериального типа (мелкие ветви улитковых артерий) по типу муфт, тем самым вы­зывая местное нарушение кровообращения поло­вого члена.

Спустя 4 недели после кастрации в глубоких отделах кавернозных тел отмечается снижение эластического каркаса, выраженное развитие фи­брозной ткани, которая сдавливает просветы сосу­дистых полостей, тем самым приводя к развитию выраженной атрофии ГМК и редукции мелких кро­веносных сосудов ветвей улитковой артерии. Ука­занные морфологические изменения, несомненно, усугубляют кровоснабжение пениса, способствуя развитию тканевой гипоксии и коллагенообразова- нию с развитием фиброза как поверхностных, так и глубоких отделов кавернозных тел.

Обсуждение

В 80-е годы прошлого столетия было сфор­мировано представление об эректильной функ­ции, как сложном физиологическом процессе, обусловленном взаимодействием сосудистых нервных, эндокринных и психологических факто­ров [26, 27]. Уже в то время было доказано, что физиологический механизм эрекции является в своей основе гемодинамическим процессом, для реализации которого необходима анатомическая и функциональная целостность всех структур по­лового члена, задействованных в реализации эректильной функции. Как показали дальнейшие исследования, повреждение любого из механиз­мов (сосудистого, нервного, гормонального, пси­хологического) неизбежно приводит к возникно­вению и развитию эректильной дисфункции. Её причины множественны (старение, сахарный диа­бет, артериальная гипертензия, тяжёлое курение, алкоголизм, пенильные травмы, повреждения кавернозных нервов при радикальной простатэктомии и т.д.), но механизмы реализации ЭД, неся в себе некоторые особенности, связанные с этиологическим фактором, тем не менее носят в целом общие черты. К таковым относят структур­ную и функциональную целостность кавернозных и дорзальных нервов, функцию гладких мышц со­судов и синусов кавернозных тел, функцию эндо­телия и поддержание механизмов метаболизма соединительной ткани пениса. Роль андрогенов в регуляции клеточной и молекулярной основы эректильной дисфункции с одной стороны явля­ется базовой, а с другой, механизмы её реализа­ции остаются неясными и продолжают изучаться. Однако какими бы ни были реакции повреждения тонких структур корпоральных тканей патофизи­ология этих процессов сопровождается наруше­нием баланса между гладкой мускулатурой и со­единительной тканью кавернозных тел полового члена. Снижение содержания в кавернозном теле ГМК и повышенное развитие соединительной тка­ни означают формирование кавернозного фибро­за, который по сути является терминальным про­цессом, приводящим к развитию необратимой эректильной дисфункции. Влияние андрогенов на развитие пенильного фиброза к настоящему вре­мени достоверно доказано. Дефицит андрогенов, т.е. тестостерона, повреждает постганглионарные парасимпатические нейроны [28], структуру дор­сального нерва полового члена [29], причём ле­чение тестостероном сразу после кастрации вос­станавливает внутрикавернозную гемодинамику [30]. Тестостерон участвует в продукции эндотели­ального NO и поддержании структуры эндотели­альных и ГМК, системы антиапоптоза, продукции белков внеклеточного матрикса [29-35]. Недоста­ток Т нарушает соотношение ГМК/коллаген путём снижения экспрессии TGF-β1, ингибируя аутофагию и стимулируя апоптоз гладких мышц у крыс [36]. Исследование K. Cui et al. в 2018 году пока­зало, что дефицит Т приводит к увеличению про­дукции коллагена I/IV типов [17].

Таким образом, несмотря на неполную яс­ность механизмов повреждения пениса при недо­статочности тестостерона, совершенно понятно, что дефицит Т бесспорно участвует в механизмах развития кавернозного фиброза.

Методической особенностью вышеперечис­ленных исследований является изучение в экс­перименте клеточных и молекулярных реакций в ответ на дефицит Т спустя 4-8 недель после хирур­гической кастрации, т.е. в те сроки когда, как пола­гают авторы исследований, в тканях полового чле­на сформированы ответные реакции на дефицит Т [14, 17, 37]. Таким образом, изучение механизмов формирования повреждения пениса в ответ на до­казанный дефицит Т вследствие кастрации проис­ходило через значительный период времени после операции. Наше исследование в отличие от выше­названных проводилось в течение первого месяца после кастрации. Оно подтвердило, что через ме­сяц после кастрации в пенисе кроликов имеет ме­сто развитой кавернозный фиброз с формировани­ем массивов коллагеновых волокон, почти полной редукцией эластичных волокон, сдавлением сину­сов и улиткообразных артерий. Вместе с тем нами показано, что уже через неделю после кастрации начинают формироваться первые признаки буду­щего фиброза. Понятно, что мы не установили в ка­кой же момент после кастрации только начинают появляться первые признаки перестройки структу­ры кавернозных тканей, но будущим исследовани­ям это предстоит сделать.

Заключение

Кастрация кроликов приводит к 10-кратному снижению уровня Т крови уже после 1 суток по­сле операции, дефицит тестостерона нарастает к 28 суткам. Морфологические признаки пере­стройки ГМК, синусов и соединительнотканных структур в кавернозных телах пениса определя­ются чётко уже к 7 дню после кастрации. Их суть сводится, как и в последующем, к дистрофии и атрофии ГМК синусов, сдавлению, сужению со­судистых структур, прогрессии межсинусного фи­броза. К 28 суткам после кастрации кавернозные ткани полового члена характеризуются тяжёлым фибротическим состоянием.