Уровень эпидермального фактора роста и его связь с лейкоцитами и тучными клетками при экспериментальном интерстициальном цистите/синдроме болезненного мочевого пузыря

Введение

Интерстициальный цистит или синдром болезненного мочевого пузыря явля­ется одним из распространённых уро­логических заболеваний, характеризующийся частотой и императивностью мочеиспускания, хронической болью в мочевом пузыре и истон­чением или изъязвлением слизистой мочевого пузыря [1-3]. Патофизиология интерстициального цистита/синдрома болезненного мочевого пу­зыря может включать хроническое воспаление, повышенный апоптоз, дисфункцию уротелия и сенсибилизацию центральной нервной системы [4, 5]. Однако, несмотря на многочисленные ис­следования интерстициального цистита/синдро­ма болезненного мочевого пузыря, его причины и механизмы остаются недостаточно изученны­ми. Патогенез заболевания все ещё не ясен, и этиология чётко не определена [2, 6, 7].

К сожалению, диагноз интерстициального цистита/синдрома болезненного мочевого пу­зыря ставится на основе оценки симптомов па­циента. Однако вызывает большой интерес роль биомаркеров мочи в оценке интерстициального цистита/синдрома болезненного мочевого пузы­ря, одним из которых является эпидермальный фактор роста [8]. Высокие концентрации эпидер­мального фактора роста могут быть обнаруже­ны в моче. На основании экспериментов in vitro было высказано предположение, что мочевой эпидермальный фактор роста происходит из уль­трафильтрата. Однако in vivo у крыс и людей было показано, что мочевой эпидермальный фактор роста в основном вырабатывается почками. По­лагают, что экскреция эпидермального фактора роста с мочой отражает продукцию его почка­ми [8]. Снижение концентрации этого фактора в моче наблюдали при диабетической нефропа­тии, IgA-нефропатии, поликистозных заболева­ниях почек у взрослых и у детей с хронической почечной недостаточностью, у детей с неблаго­приятным течением хронического пиелонефрита [9, 10]. Считается, что концентрация эпидермаль­ного фактора роста в моче может служить сур­рогатным маркёром регенерации почечных ка­нальцев, отражая их способность реагировать на будущие острые или хронические повреждения [9]. По результатам немногочисленных исследо­ваний концентрация эпидермального фактора роста в моче снижается с возрастом [9].

В связи со сложностью патофизиологии ин­терстициального цистита/синдрома болезненно­го мочевого пузыря используются ряд моделей на животных, чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе этого заболевания. Модели­рование часто создаётся путём внутрипузырной инстилляции протамина сульфата, введением циклофосфамида и др. [11]. На протяжении бо­лее двух десятилетий в исследованиях интерсти­циального цистита/синдрома болезненного мо­чевого пузыря активно использовались модели животных с аутоиммунным воспалением моче­вого пузыря [12, 13]. Исследования на животных показали, что за воспаление мочевого пузыря и боль в различных моделях ответственны тучные клетки [12]. Однако, несмотря на эти исследова­ния, роль тучных клеток, связанных с циститом, не была идентифицирована.

Данные гистопатологии мочевого пузыря вы­явили роль клеточно-опосредованных иммунных механизмов в интерстициальном цистите/син­дроме болезненного мочевого пузыря, что не ис­ключают того, что аутоиммунное воспаление, ве­роятно, является компонентом патофизиологии в подгруппах пациентов с этим заболеванием [14].

Таким образом, хотя эпидермальный фактор роста, как один из трёх биомаркеров выявлен в моче пациентов с интерстициальным циститом/ синдромом болезненного мочевого пузыря, но клиническая значимость различий в уровнях эпи­дермального фактора роста в настоящее время неясна.

Цель исследования - определение уровня эпидермального фактора роста и его ассоциации с лейкоцитами и тучными клетками в тканях мо­чевого пузыря у животных с экспериментальны­ми моделями интерстициального цистита/син­дрома болезненного мочевого пузыря.

Материалы и методы

Моделирование ИЦ/СБМП проведено на 29 белых новозеландских кроликах-самках мас­сой 1500-2000 г. При содержании животных и проведении экспериментальных исследований соблюдали правила по уходу и использования лабораторных животных (NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) [15].

Моделирование ИЦ/СБМП на кроликах было создано несколькими путями, в связи с чем жи­вотных разделили на 4 группы (табл. 1).

Животных подвергали воздействию протами­на сульфата, мочи, физ. раствора (NaCl). У живот­ных 1 группы интерстициальный цистит/синдром болезненного мочевого пузыря был вызван внутрипузырной инстилляцией протамин сульфата (10 мг). У животных 2 группы модель этого забо­левания создана на основе одной из этиологиче­ских теорий интерстициального цистита, согласно которой к поражению гликозаминогликанового слоя приводит мочевая токсичность [16]. Кро­ликам был сделан надлобковый разрез, после чего взятая из мочевого пузыря моча шприцем с иглой 30-го калибра в объёме 0,5 см³ введена под слизистый слой мочевого пузыря. Живот­ным 3 группы в стенку мочевого пузыря вводили 10 мл NaCl. После введения мочи в стенку моче­вого пузыря через 14 дней у кроликов отмечалась вялость, об интерстициальном цистите судили по цистоскопической картине, полученной при про­ведении цистоскопии.

Эпидермальный фактор роста определяли в крови и моче твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) с помощью набора EGF (Cusabio Biotech Co., Ltd., Китай). Измерения про­водили через 1 и 14 дней после создания экспе­риментальной модели.

Для оценки клеток в тканях, животных после 14 дней умерщвляли пентобарбиталом в дозе по 200 мг/ кг. После этого их рассекали с помощью трансабдоминального разреза по средней ли­нии и выполняли цистэктомию. Взятые образцы ткани мочевого пузыря заключали в парафин; с помощью микротома готовили срезы толщиной 4 мкм. Затем образцы окрашивали гематокси­лин-эозином для оценки количества лейкоцитов и толуидиновым синим для оценки тучных кле­ток. Для просмотра микропрепаратов использо­вали световой микроскоп Olympus Bx 50 и систе­му камер Olympus PM10SP. Каждое поперечное сечение было разделено на 10 участков, лейко­циты и инфильтрация тучных клеток оценивали в каждом из 10 участков с помощью следующей шкалы: 0 - нет экстраваскулярных лейкоцитов и тучных клеток; 1 - менее 20 лейкоцитов и тучных клеток; 2 - 20-45 лейкоцитов и тучных клеток; 3: - более 45 лейкоцитов и тучных клеток. Баллы всех 10 срезов складывали, делили на 30 (максималь­но возможный балл) и умножали на 100. Баллы по лейкоцитам и тучным клеткам для каждого мочевого пузыря были средними из 3 исследо­ванных сечений. Подсчёт лейкоцитов и тучных клеток проводили при оптическом увеличении х 200 [17, 18].

Статистическая обработка полученных дан­ных проведена с помощью программ «Statistica for Windows 8.0» и «Microsoft Excel». Рассчитаны среднее значение (average), стандартное откло­нение среднего (Standard Deviation). Различия считали достоверными при значении p<0,05. Корреляционную зависимость между показате­лями рассчитывали по коэффициенту корреля­ции Пирсона.

Результаты

Результаты исследования уровня эпидер­мального фактора роста в экспериментальных группах представлены в таблице 2.

Согласно данным исследования, через день после моделирования уровень эпидермально­го фактора роста в крови в экспериментальных группах относительно интактной группы суще­ственно не различался. Значительных различий этого фактора в крови между моделями интер­стициального цистита/синдрома болезненного мочевого пузыря также не отмечалось. Сравни­тельно высокий уровень эпидермального факто­ра роста в моче выявлялся у кроликов 1 и 2 груп­пы, который превышал показатель интактной группы на 33,3% (р<0,05) и 34,6% (р<0,05) соот­ветственно. У животных 3 группы концентрация этого показателя в моче в сравнении с интактной группой была незначительно снижена. Спустя 14 дней наиболее высокий уровень эпидермально­го фактора роста в крови и в моче определялся у животных 2 группы. У кроликов этой группы со­держание эпидермального фактора роста в кро­ви в сравнении с интактными животными было выше на 63,1% (р<0,01), в 3 группе уровень ЭФР был ниже на 61,3% (р<0,01). В данный срок на­блюдения значение эпидермального фактора роста в моче в 1 и 3 группах было незначительно ниже интактной группы, а во 2 группе, напротив, выше на 49,2% (р<0,05). Сравнительный анализ уровня эпидермального фактора роста в груп­пах через 1 и 14 дней показал снижение его кон­центрации в крови и в моче в 1 группе спустя 14 дней соответственно на 16,2% и 35,5% (р<0,05). Во 2 группе уровень эпидермального фактора роста повысился, причём, как в крови (на 61,2%, р<0,01), так и в моче (на 28,7%). В 3 группе ди­намика значения эпидермального фактора роста показала снижение в крови (на 50,2%, р<0,05) и в моче (на 12,3%).

При определении коэффициента корре­ляции в экспериментальных моделях между величинами эпидермального фактора роста в крови и моче выявлены положительные связи (рис. 1).

Исследование в динамике свидетельствова­ло о снижении высокой прямой корреляции в 1 группе, наблюдаемой через день после моде­лирования, до очень слабой после 14 дней; во 2 группе корреляционная связь также ослабля­лась, тогда как в 3 группе отмечалось усиление взаимосвязи от умеренной до заметной. В груп­пе интактных животных показатели эпидермаль­ного фактора роста в крови и моче коррелирова­ли обратной умеренной связью.

Исследование уровня типов лейкоцитов по­казало, что наибольшее количество нейтрофилов и эозинофилов определялось в ткани мочевого пузыря у животных 1 группы (табл. 3).

Среднее число нейтрофилов и эозинофилов в этой группе статистически значимо превыша­ло таковой во 2 и 3 группе, а также в 4 группе (р<0,001). Наибольшее количество лимфоцитов выявлено у животных 2 группы, что статистиче­ски значимо (р<0,001) выше, чем в остальных группах. Тучные клетки определялись лишь в 1 и 2 группах, причем в последней их число ста­тистически значимо было больше (р<0,001), чем в 1 группе. 

В 1 группе отмечалась положительная кор­реляция уровня эпидермального фактора роста в крови, в моче - отрицательная корреляция со всеми типами лейкоцитов и тучными клетка­ми (табл.4). При этом сильная корреляционная взаимосвязь выявлена между значением эпи- дермаольного фактора роста в крови и тучными клетками, а также между его уровнем в моче и эозинофилами. Во 2 группе исследования уме­ренная отрицательная связь обнаруживалась между концентрацией эпидермального фактора роста в моче и количеством нейтрофилов. У жи­вотных этой группы отмечалась прямая слабая связь между концентрацией эпидермального фактора роста в моче и количеством лимфоци­тов и тучными клетками. В 3 группе уровень эпи­дермального фактора роста в крови практически не коррелировал с лейкоцитами, лишь умерен­ная положительная связь отмечалась между его содержанием в моче и эозинофилами. У кон­тактных кроликов определялась положительная умеренная корреляция эпидермального факто­ра роста с лимфоцитами и эозинофилами, при­чём с одинаковым значением в крови и моче.

Обсуждение

Таким образом, наиболее выраженные из­менения уровня эпидермального фактора роста в крови и моче выявлены в группе модели ин­терстициального цистита/синдрома болезненно­го мочевого пузыря, созданной путём введения мочи из мочевого пузыря в его стенку. Нужно отметить, что эпидермальный фактор роста от­носится к группе факторов роста (цитокины) и представляет собой полипептид с молекулярной массой 6000, был впервые выделен в 1975 году [19]. Установлено, что эпидермальный фактор роста стимулирует рост, пролиферацию и дифференцировку клеток путём связывания со своим рецептором [9]. Показано, что эпидермальный фактор роста - это мощный митоген, стимули­рует синтез мРНК, ДНК и белков эпителиальных клеток. Он локально продуцируется в нескольких тканях, таких как петля Генле и дистальные из­витые канальцы в почках. В почках эпидермаль­ный фактор роста участвует в восстановлении почечных тканей [9]. На модели острой почечной недостаточности на животных он оказался мощ­ным стимулятором роста, регенерируя почечные канальцевые клетки и ускоряя восстановление нормальной функции почек [9]. Эпидермальный фактор роста защищает слизистую оболочку от повреждений, вызванных стрессом или различ­ными некротизирующими агентами, такими как этанол [14].

Учитывая, что эпидермальный фактор роста является митогеном уротелиальных и гладкомы­шечных клеток и усиливают пролиферацию, а также является продуктом многих эпителиальных клеток [8], можно предположить, что поврежде­ние глюкозаминогликанового слоя мочевого пу­зыря, который имел место при создании модели путём введения мочи в стенку мочевого пузыря, способствует повышению уровня эпидермаль­ного фактора роста, который стимулирует кле­точную пролиферацию. Длительность такого со­стояния мочевого пузыря ещё более усиливает корреляционную связь между уровнем этого фактора в крови и моче, о чем свидетельствует коэффициент корреляции во 2 варианте экспе­риментальной модели после 14 дней исследова­ния. У животных этой экспериментальной группы отмечалась высокая инфильтрация тучных клеток в ткани. В модели интерстициальный цистит/син­дром болезненного мочевого пузыря, созданной путём введения в полость мочевого пузыря протамин сульфата, активация тучных клеток была незначительной.

Известно, что тучные клетки развивают фун­даментальную защитную и иммунорегулятор- ную функцию, особенно на границе слизистой оболочки, способствуют врожденному и при­обретенному иммунитету и являются важны­ми эффекторными клетками в защите хозяина. Активация тучных клеток вызывает дегрануля­цию и высвобождение медиаторов воспаления, включая, цитокины [14]. Универсальность тучных клеток подразумевает, что они могут быть акти­вированы различными механизмами. Считается, что тучные клетки играют важную роль в интер­стициальном цистите/синдроме болезненного мочевого пузыря, поскольку во многих случа­ях наблюдается увеличение количества тучных клеток в мочевом пузыре [14]. Исследования на животных показали, что тучные клетки незаме­нимы для развития воспаления мочевого пузыря и боли, наблюдаемой при интерстициальном ци­стите/синдроме болезненного мочевого пузыря [12].

В данном исследовании мы моделировали интерстициальный цистит/синдром мочевого пузыря введением в мочевой пузырь протамин сульфата, в стенку мочевого пузыря мочи и NaCl. Согласно нашим данным, тучные клетки в ткани мочевого пузыря существенно активизировались под воздействием мочевой токсичности.

Заключение

Настоящее исследование демонстрирует статистически значимое повышение эпидер­мального фактора роста в крови и моче у жи­вотных с моделированным интерстициальным циститом/синдромом болезненного мочевого пузыря путём введения мочи в стенку мочевого пузыря. Этот вариант моделирования способ­ствовал активизации тучных клеток ткани моче­вого пузыря. Выявлена ассоциация эпидермаль­ного фактора роста с тучными клетками при интерстициальном цистите/синдроме болез­ненного мочевого пузыря. Полученные данные показывают, что изменения уровней эпидер­мального факторов роста могут быть связаны с интерстициальным циститом/синдромом моче­вого пузыря. Мы считаем, что выявленные кор­реляционные взаимосвязи указывают на при­чинно-следственные связи