Оценка влияния L-карнитина на качество эякулята в экспериментальной модели варикоцеле

Введение

Бесплодие является глобальной проблемой, затрагивающей около 15% супружеских пар, что составляет примерно 48,5 миллиона пар во всем мире. Согласно статистике, мужской фактор является причиной бесплодия в 50% случаев, и это определяет высокую актуальность для изучения его развития и способов лечения [1][2]. В целом причины нарушения сперматогенеза разнообразны, но непосредственный механизм повреждения тестикулярной ткани достаточно универсален и сводится к явлению оксидативного стресса [3][4].

Одной из причин патоспермии с хорошо изученным механизмом альтерации является варикоцеле [5 – 8]. Предопределяют оксидативный стресс при варикоцеле такие факторы, как гипоксия, локальная гипертермия, микроделеции митохондриальных генов, недостаточность белков теплового шока, экспрессии каспаз, Bak, р53 и ряда других факторов, нарушающих соотношение пролиферация / апоптоз сперматогенных клеток [9].

Считается, что антиоксиданты улучшают качество спермы за счёт уменьшения окислительного повреждения [10][11]. Высокую эффективность антиоксидантов демонстрируют результаты ряда научных исследований [3][4][12]. Так, недавний систематический обзор сообщает о повышении частоты клинической беременности при приёме антиоксидантов (ОШ 1,89; 95% ДИ от 1,45 до 2,47; р < 0,00001) 20 рандомизированных клинических исследований (1706 мужчин, I2 = 3%) по сравнению с плацебо, но при доказательствах низкой определённости. Несмотря на полученное отношение шансов, авторы говорят о необходимости дальнейших крупных, хорошо спланированных рандомизированных плацебо-контролируемых исследований для выяснения точной роли антиоксидантов в лечении бесплодных мужчин с оценкой о наступлениях беременности и живорождениях [13].

Одним из широко обсуждаемых веществ в контексте антиоксидантной терапии мужского бесплодия является L‑карнитин. Это достаточно давно известная аминокислота, обнаруживаемая в придатках яичка, семенной плазме и сперматозоидах. Карнитины участвуют в метаболизме сперматозоидов, положительно влияя на их подвижность и созревание [14]. В последние годы были опубликованы работы, посвящённые различным аспектам применения L‑карнитина непосредственно при варикоцеле [10][11][15], однако результаты исследований весьма неоднозначны [16], что диктует необходимость дальнейшего изучения проблемы.

Одним из путей изучения влияния различных видов лечения на процесс нарушенного сперматогенеза, помимо клинических исследований, является экспериментальный. В связи с этим представляется обоснованным изучение различных вариантов фармакологической поддержки сперматогенеза в хроническом эксперименте на животных. Варикоцеле является патологией, относительно легко моделируемой в хроническом эксперименте. А поскольку оно включает в себя основной набор альтерирующих ткань яичка при мужском бесплодии факторов, то именно модель варикоцеле представляется возможным использовать для изучения эффективности медикаментозной коррекции нарушения функции гонад [17][18].

Цель исследования: изучить влияние L‑карнитина на показатели спермограммы при экспериментальном варикоцеле.

Материалы и методы

В хроническом эксперименте были задействованы 15 половозрелых кроликов-самцов породы Серый Великан (Oryctolagus cuniculus) в возрасте 4,5 – 5,5 месяца. Средняя масса животного составила 3 кг. К вязке животных не допускали. Эксперимент проведён в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Исследование выполнено на базе кафедры анатомии, гистологии, физиологии и патологической анатомии факультета ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета им. П.А. Столыпина. Исследование одобрено ЛЭК ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России (№ 111, от 14.06.2019 года).

Перед проведением исследования каждому животному был присвоен индивидуальный номер от 1 до 15. Все животные были рандомизированы и распределены на три группы:

• Группа 1 — интактные животные. Предоставление нормальной анатомии семенника и показателей спермограммы (n = 5).
• Группа 2 (группа контроля) — животные с моделью варикоцеле без лекарственного воздействия, вывод из эксперимента через 1 месяц после формирования патологии (n = 5).
• Группа 3 (основная группа) — животные с моделью варикоцеле и лекарственным воздействием в течение 1-го месяца с момента формирования патологии (n = 5).

Создание варикоцеле в эксперименте. Варикоцеле создавали путём сужения просвета почечной вены на 1/2 – 2/3 исходного диаметра и дополнительного парентерального введения гонадотропина 300 ед/кг веса и 0,2 мл 1% раствора прогестерона в сутки в течение 10 суток, начиная за сутки до сужения почечной вены. Критерием создания модели варикоцеле считали регистрацию при дуплексном ангиосканировании увеличения диаметра вен семенного канатика в 2 раза от исходного / сам факт их визуализации / регистрация рефлюксной волны крови длительностью более 1 секунды. Рефлюкс провоцировали мануальной компрессией брюшной полости (приём, заменяющий пробу Valsalva, в связи с тем, что волевое натуживание у животного невозможно) [18][19].

Основные этапы операции: под общей анестезией выполняли лапаротомию левым боковым доступом, в забрюшинной клетчатке выделяли левую почечную и впадающую в неё левую яичковую вены. Дистальнее яичковой вены лигировали почечную вену на 1/2 – 2/3 просвета сосуда монофиламентной нерассасывающейся нитью (4-0) (рис. 1, 2).

Для контроля формирования варикоцеле на 7-е, 14-е и 30-е сутки выполняли ультразвуковое исследование семенников в режиме серой шкалы и допплеровского картирования. Модель формировалась к исходу 7-х суток с момента операции.

В группе 3 введение тестируемых образцов препарата осуществляли в течение 1 месяца (через 7 дней после операции по созданию модели).

В экспериментальных группах препарат в форме порошка вводили внутрижелудочно в дозе по L‑карнитину 26,15 мг/сут с пересчётом на видовые особенности обмена веществ кролика [20].

Сбор и подготовка проб. Сбор эякулята осуществляли при помощи искусственной вагины для кролика. Семенную жидкость исследовали при помощи световой микроскопии с оценкой количества и качества сперматозоидов.

Животные групп 2 и 3 выведены из эксперимента через 1 месяц.

Статистический анализ. Обработка и анализ массива статистических данных выполнялись с помощью пакета прикладных программ “IBM SPSS Statistics v.22.0” (SPSS: An IBM Company, IBM SPSS Corp., Armonk, NY, USA). Нормальность распределения проверяли с помощью теста Shapiro-Wilk. Количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей [ Q1; Q3]. Категориальные данные описывались с указанием абсолютных значений (n) и процентных долей (%). Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью U-критерия Mann-Whitney c модулем Probabilistic Index при неравенстве дисперсий (M-W test). Сравнение процентных долей при анализе многопольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью критерия Pearson`s chi-square (χ²). Принятые уровни достоверности р < 0,05, <0,01.

Результаты

При ультразвуковом ангиосканировании у животных группы 1 лишь у одного была зафиксирована семенная вена диаметром 0,6 мм. У остальных — не визуализированы. Рефлюкса также не было. Объём семенника в среднем составил 0,77 см³.

Спустя 14 суток от создания модели у всех животных групп 2 и 3 визуализированы семенные вены (до 1,8 мм, р > 0,05 между группами) и зарегистрирован рефлюкс (рис. 3A, 3B). Средний диаметр семенных вен (до 2,1 мм) был зарегистрирован на 30-е сутки.

Отмечено прогрессирующее уменьшение объёма левого семенника в течение 30 суток в среднем на 0,6 см³ (с 0,77 см³ до 0,71 см³) (p > 0,05 между группами).

При анализе спермограмм в группе 3 отмечена в разной степени положительная динамика, что отражено в таблице.

Сравнительный анализ спермограмм групп 2 и 3 продемонстрировал наличие различий от нормы по всем оцениваемым показателям.

В группе 1 исходные характеристики общих показателей спермограммы были достоверно выше, чем в группах 2 и 3 (p < 0,05 — 0,01). Общее количество сперматозоидов — 310,2 млн (группа 1), 199,3 млн (группа 2) и 247,6 млн (группа 3). В группе 1 из общего количества 310,2 млн 94,3% — живые формы, PR + NP — 91,4%, PR — 87,2% и скоростью сперматозоидов — 13 мк/с.

Показатели спермограммы в группе 2 были значимо ниже, чем в группе 3 с соотношением: общее количество сперматозоидов — 199,3 / 247,6 млн (живые формы — 68,3 / 80,6%; PR + NP — 61,5 / 73,4%; PR — 48,7 / 65,4%; скорость сперматозоидов — 4 / 8 мк/с) (p < 0,01).

Таким образом, животные группы 3 имели лучшие показатели сперматогенеза, в отличие от группы 2.

Обсуждение

Согласно данным литературных источников, у мужчин с первичным бесплодием варикоцеле встречается в 35 – 40% случаев, а при вторичном бесплодии данный показатель может достигать 80% [12]. Патогенез бесплодия, вызванного варикоцеле, представляет собой сложный процесс, включающий различные механизмы, оказывающие пагубное воздействие на сперматогенез [21], что подтверждается результатами настоящего исследования. Одним из ведущих механизмов в патогенезе бесплодия, ассоциированного с варикоцеле, является оксидативный стресс [12][22]. Варикоцеле может приводить к повышению активных форм кислорода, изменению уровня гормонов, нарушению плотных контактов между поддерживающими клетками и повреждению гематотестикулярного барьера [21]. Повреждение гематотестикулярного барьера может стимулировать аутоиммунную реакцию в яичках с агглютинацией сперматозоидов, снижением количества, концентрации, подвижности сперматозоидов и, в итоге, развитием бесплодия [21].

Результаты настоящего исследования указывают на существенную роль варикоцеле в развитии патоспермии, что согласуется с данными, полученными в исследованиях других авторов [22][23]. Так, в исследовании Р.И. Панченко с соавторами (2022) у пациентов, страдающих варикоцеле, в 100% случаев регистрировалась астенозооспермия, в 14% — олигозооспермия, в 23% — тератозооспермия [22].

На сегодняшний день результаты многих исследований демонстрируют эффективность варикоцелэктомии при лечении бесплодия у мужчин с варикоцеле. После хирургического вмешательства отмечено улучшение качества эякулята [24]. Между тем существует только три показания для хирургического лечения варикоцеле: наличие болевого синдрома в мошонке при физической нагрузке; нарушения сперматогенеза, приводящие к мужскому бесплодию и / или репродуктивным потерям; прогрессирующая гипотрофия яичка на стороне поражения [25]. Данный факт обусловливает необходимость поиска эффективных методов консервативного лечения и профилактики патоспермии при варикоцеле, что доказывают результаты многоцентрового исследования A. Shomarufov et al. (2025), посвящённого оценке эффективности микрохирургической варикоцелэктомии и антиоксидантной терапии в улучшении показателей спермы и снижении фрагментации ДНК. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что микрохирургическая варикоцелэктомия наряду с антиоксидантной терапией способствует улучшению параметров спермы: повышению концентрации сперматозоидов и их подвижности. По мнению авторов, антиоксидантная терапия является хорошей альтернативой или дополнением при лечении пациентов с варикоцеле, которым не показано оперативное лечение [23], что также подтверждает настоящее исследование.

Довольно большое количество экспериментальных и клинических исследований посвящено оценке роли антиоксидантов при лечении инфертильных пациентов с варикоцеле [12]. Среди иных антиоксидантов большой интерес учёных вызывает L‑карнитин, установлено его снижение у мужчин с варикоцеле и патоспермией. Так, T. Mostafa et al. (2022) изучали уровень L‑карнитина в семенной плазме 86 мужчин: 45 мужчин с бесплодием, вызванным азооспермией и варикоцеле, 21 мужчина с бесплодием, вызванным азооспермией, без варикоцеле, и 20 фертильных мужчин. Авторы установили, что средние уровни L‑карнитина в семенной плазме были значительно ниже у бесплодных мужчин с олигоастенотератозооспермией с варикоцеле (216,3 ± 57,1 нг/мл) по сравнению с бесплодными мужчинами олигоастенотератозооспермией без варикоцеле (252,9 ± 62,9 нг/мл; р = 0,01) или фертильными мужчинами (382,8 ± 63,6 нг/мл; р = 0,001) [26].

L‑карнитин — эндогенный метаболит, представляющий собой четвертичный амин, основной функцией которого в клетках млекопитающих является перенос длинноцепочечных жирных кислот через внутреннюю митохондриальную мембрану для β-окисления и выработки энергии АТФ. L‑карнитин является мощным антиоксидантом, поглощающим свободные радикалы, кроме того, он поддерживает уровень свободного кофермента А в митохондриях [4]. По данным ряда исследований, приём L‑карнитина способствует улучшению параметров спермы: концентрации, подвижности сперматозоидов, общего количества эякулированных сперматозоидов [3]. Однако при проведении систематического обзора G. Tsampoukas et al. (2020) сделал выводы, что доказательств, подтверждающих роль L‑карнитина в качестве основного или вспомогательного средства при лечении варикоцеле, недостаточно, а имеющиеся на данный момент доказательства противоречивы [16].

Результаты настоящего исследования выявили наличие достоверных различий показателей спермограммы у лабораторных животных с варикоцеле со значительным их улучшением в группе животных, получающих L‑карнитин. Исследования in vitro показывают, что L‑карнитин оказывает прямое влияние на клетки Sertoli, улучшая развитие половых клеток и положительно влияя на мужскую фертильность [27].

Заключение

В эксперименте на модели варикоцеле, при сохраняющемся действии альтерирующего фактора, применение антиоксидантного комплекса на основе L‑карнитина повышает качественные и количественные параметры эякулята.