Микробиота мочепузырной мочи у детей с пузырномочеточниковым рефлюксом перед его оперативным лечением

Введение

Инфекции мочевых путей (ИМП) являются одной из наиболее частых форм бактериального воспаления у детей, особенно в сочетании с анатомическими аномалиями мочевыводящих путей, в том числе с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (ПМР) [1][2]. Микробиологическая оценка мочи у детей, страдающих ИМП, выявляет широкий спектр патогенов с преобладанием Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella spp., Enterococcus spp. [1][3].

Одним из ключевых аспектов проблемы является то, что ПМР чаще всего диагностируется после эпизода(ов) ИМП, что указывает на тесную связь между этими состояниями, поэтому выявление ПМР на ранних этапах ИМП имеет важное клиническое значение, так как запоздалая диагностика сопряжена с высоким риском развития хронических почечных осложнений, включая рубцевание почек, артериальную гипертензию и в тяжёлых случаях — хроническую почечную недостаточность и рефлюкс-нефропатию [1][4][5].

Тактика ведения пациентов с неосложнённой первой фебрильной ИМП на сегодняшний день является предметом дискуссии [1][6]. Зачастую мнение педиатров, считающих необходимым проводить обширное обследование только после второй фебрильной ИМП, коренным образом расходится с таковым детских урологов, склоняющихся к незамедлительной визуализации и антибиотикопрофилактике (АБП) и / или хирургической коррекции в случае выявления ПМР [6].

АБП является важным компонентом тактики ведения детей с ПМР, особенно в периоде перед хирургической коррекцией ПМР. Она направлена на предотвращение ИМП и последующих инфекционных осложнений, которые могут ухудшить состояние пациента и повлиять на исход операции [6]. Однако эффективность длительной АБП остаётся вопросом открытым, как, впрочем, и сроки рациональной АБП [7][8]. В некоторых исследованиях подчёркивается неоспоримый вклад АБП в снижение частоты рецидивов ИМП у пациентов с ПМР [9], в то время как другие исследователи указывают на развитие устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам, что снижает эффективность лечения и увеличивает риск возникновения осложнений [10][11]. Ранее было отмечено, что даже кратковременное воздействие антибиотиков изменяет состав кишечной микробиоты, увеличивая относительное обилие условно-патогенных микроорганизмов и уменьшая долю таксонов, способствующих укреплению здоровья, что в итоге может быть сопряжено с потенциальными долгосрочными клиническими рисками [12]. Поэтому закономерно возникает вопрос о поисках альтернативы непрерывной АБП в виде более безвредных подходов.

Микробиологическая оценка мочи перед хирургической коррекцией ПМР является обязательным этапом для определения наличия активного инфекционного процесса и назначения соответствующего лечения [3][5]. Уровень бактериурии 10⁵ КОЕ/мл и более считается лабораторным подтверждением диагноза ИМП [5]. Но так ли это, если принять во внимание современные представления о микробиоте / микробиоме мочи у человека?

В этой связи цель настоящего исследования заключается в оценке микробиоты мочепузырной мочи перед операцией по поводу ПМР у детей.

Материалы и методы

В исследование включены 40 детей (12 мальчиков — группа 1, 28 девочек — группа 2), у которых ПМР выявлен после манифестной инфекции мочевых путей (одного или нескольких эпизодов).

Антенатально гидронефроз с двух сторон был выявлен у двух (5%) пациентов. Диагноз ПМР был поставлен пациентам в интервале от 1 до 147 месяцев. Медиана возраста — 28 [ 12; 72,5] месяцев. Двухсторонний рефлюкс был у 22 (55%) детей, левосторонний — у 13 (32,5%), правосторонний — у 5 (12,5%) пациентов. Рефлюкс I ст. диагностирован в 2 почечные единицы (ПЕ), II ст. — в 4 ПЕ, III — в 46 ПЕ, IV ст. — в 9 ПЕ. Активный ПМР выявлен в 16 ПЕ (17,5%), пассивный — в 2 ПЕ (5%), смешанный — в 42 ПЕ (77,5%). Всем пациентам было выполнено эндоскопическое лечение рефлюкса с использованием в качестве объём-образующих препаратов стабильных имплантов (рефлюксин — 26, DAM + — 9, вантрис — 5 детей). Возраст хирургического лечения 10 – 149 месяцев. Медиана возраста хирургического лечения — 60 [ 24; 91] месяцев.

В качестве контрольных групп послужили 18 здоровых мальчиков (группа 3) и 16 здоровых девочек (группа 4).

Критерии включения в исследование для групп 1 и 2: ПМР с неэффективной антибиотикопрофилактикой и повторением эпизодов ИМП и признаками прогрессии рефлюкс-нефропатии.

Критерии исключения для групп 1 и 2: ранее выполнявшиеся оперативные вмешательства на мочевых путях, пациенты, находящиеся на пролонгированном постоянном дренировании мочевого пузыря (эпицистостома, уретральный катетер) и периодической стерильной катетеризации мочевого пузыря.

Критерии включения в исследование для групп 3 и 4: первая группа здоровья, отсутствие структурных аномалий мочевой системы, отсутствие приёма каких-либо препаратов, в том числе антимикробных, в течение трёх месяцев до включения. Критерии исключения: текущая или рецидивирующая ИМП, дневное недержание мочи и / или ночной энурез, дисфункция кишечника.

Пациентам групп 1 и 2 забор мочи для бактериологического исследования осуществляли в операционной после обработки наружных половых органов растворами антисептиков путём введения в мочевой пузырь катетера Nelaton 8 Ch. Лейкоцитурия перед операцией имела место только у двух пациентов. Детям 3 и 4 групп производили забор средней порции утренней мочи. Сбор мочи и её культуральное исследование осуществляли в соответствии с клиническими рекомендациями РФ [13]. Помимо стандартных питательных сред были дополнительно использованы 10 – 12 питательных сред для аэробных и анаэробных таксонов микробиоты, соответственно, в аэробных и анаэробных условиях культивирования с последующей идентификацией [14].

Статистический анализ. Статистические расчёты проводили с применением статистического пакета IBM SPSS Statistics v.23.0 (SPSS: An IBM Company, IBM SPSS Corp., Armonk, NY, USA). Для микроорганизмов, выделенных из мочи, рассчитаны показатели и частоты обнаружения — абсолютное количество (n), доли в процентах (%). Степени обсеменённости (бактериурия) не подчиняются нормальному распределению (согласно критериям Колмогорова-Смирнова с коррекцией значимости Lilliefors и Shapiro-Wilk) и представлены значениями медианы (Ме) и квартилей [нижнего (LQ) – верхнего (UQ)]. Сравнение данных показателей выполнено с использованием непараметрического критерия Mann-Whitney. Для сравнения частот обнаружения микроорганизмов использован критерий хи-квадрат Pearson и точный критерий Fisher. Корреляционный анализ представлен коэффициентами взаимной сопряжённости Pearson для частот обнаружения микроорганизмов (с проверкой значимости по критерию хи-квадрат). Для принятия решений использованы уровни значимости p <0,01 и <0,05.

Результаты

Медианный возраст пациентов групп 1 и 2 составил 3,6 [ 1,9 – 7,11] года, мальчиков — 2,15 [ 1,53 – 8,38] года, девочек — 5,6 [ 2,11 – 7,11] года. По возрасту исследуемые группы достоверно не различались (p = 0,323), но по гендерному признаку девочек было достоверно больше, чем мальчиков (p < 0,001). Медианный возраст обследуемых групп 3 и 4 достоверно не отличался от аналогичных показателей групп 1 и 2 — 3,9 [ 2,2 – 8,42].

Моча пациентов групп 1 и 2 во всех случаях была нестерильна (табл. 1). В ней было обнаружено 27 таксонов микроорганизмов: 16 — аэробных и 11 — анаэробных. В группе 1 спектр микробиоты оказался уже (19), чем в группе 2 (25). Причём данный факт касался как аэробного, так и анаэробного кластеров микроорганизмов. Достоверных отличий частот обнаружения микроорганизмов в моче пациентов групп 1 и 2 не обнаружено, однако отмечены различия в доминировании таксонов в аэробном звене микробиоты. Так, в группе 1 преобладали представители порядка Enterobacterales (41,7%), в группе 2 — коагулазонегативные стафилококки (CNS) (53,6%) и Corynebacterium spp. (46,4%). В анаэробном кластере микроорганизмов в обеих группах доминировали Peptococcus spp. (по 41,7%), а в группе 1 с такой же частотой из мочи выделяли Anaerococcus spp. Медиана уровня бактериурии для большинства таксонов в исследуемых группах составила 10² КОЕ/мл, за исключением E.coli и Klebsiella spp., уровни которых были достоверно выше — 10² КОЕ/мл.

В моче пациентов групп 1 и 2 в большинстве случаев (75% и 96,4% соответственно) микроорганизмы присутствовали в составе бактериальных ассоциаций (рис. 1). Моноварианты выделены из мочи у трёх (25,0%) пациентов группы 1 и одного пациента (3,6%) группы 2. Причём в этих четырёх случаях в моче обнаруживали только Anaerococcus spp.

Логично предположить, что когда микроорганизмы в подавляющем большинстве случаев выделяются из мочи в составе различных вариантов многокомпонентных ассоциаций, то между ними бесспорно существуют эволюционно сложившиеся взаимосвязи. Так, в моче пациентов групп 1 и 2 было обнаружено 38 вариантов значимых коэффициентов взаимной сопряжённости Pearson (Кп) (из них 17 — в группе 1; и 21 — в группе 2), показывающих прямые прочные связи между различными таксонами микробиоты (табл. 2).

Достоверно чаще (p < 0,05) в моче пациентов обеих групп обнаруживаются корреляции между аэробными и анаэробными таксонами микробиоты (63,2%), значимо реже — между аэробными (29,0%) и только в группе 1 выявлены корреляции между отдельными таксонами анаэробной микробиоты (7,8%).

Частоты обнаружения различных таксонов микробиоты, верифицированных в моче пациентов с ПМР (группы 1 и 2) по сравнению с аналогичными показателями у здоровых детей (группы 3 и 4), представлены в таблице 3.

У пациентов группы 1 в сравнении со здоровыми мальчиками (группа 3) имеет место снижение частот присутствия в моче CoNS, энтерококков, коринебактерий на фоне достоверного повышения представителей порядка Enterobacterales и разнонаправленного изменения частот присутствия всех анаэробных бактерий.

У пациенток группы 2 в сравнении со здоровыми девочками (группа 4) отмечены разнонаправленные изменения частот присутствия в моче различных видов CNS, анаэробных бактерий при снижении частот обнаружения энтерококков, коринебактерий, E. coli.

У мальчиков достоверность изменений частот присутствия тех или иных бактерий в моче при ПМР в отличие от здоровых встречается чаще, чем у девочек.

Уровни бактериурии в группах 1 – 4 представлены в таблице 4.

Медиана уровней бактериурии для большинства таксонов мочи была 10² КОЕ/мл. Установлено равное количество таксонов мочи у здоровых мальчиков и при ПМР (по 20 видов бактерий), в то время как у девочек с ПМР выявлено 26 таксонов мочи в сравнении с 18 у здоровых за счёт расширения спектра как аэробных, так и анаэробных бактерий.

Достоверные различия для мальчиков и девочек зафиксированы для представителей Enterobacterales, уровни которых были повышены при ПМР. Кроме того, у девочек с ПМР были недостоверно снижены уровни лактобацилл в моче и незначительно повышены уровни Peptostreptococcus spp.

В целом из мочи детей 1 – 4 групп выделено 29 таксонов микробиоты: 17 — аэробных, 12 — анаэробных.

Наличие в моче широкого паттерна микроорганизмов в различных ассоциациях у здоровых детей и имеющих ПМР позволило обнаружить варианты достоверной взаимосвязи между ними (табл. 5).

В моче здоровых детей (группы 3, 4) обнаружены 29 статистически значимых корреляционных связей между микроорганизмами, из них 17 — в группе 3, 12 — в группе 4. В этих группах преобладали аэробно-анаэробные взаимосвязи (58,6%): 37,9% — в группе 3, 20,7% — в группе 4. Аэробно-аэробные достоверные корреляции обнаружены в обеих группах в 31,1% наблюдений, а анаэробно-анаэробные взаимосвязи — только в моче обследуемых группы 3 (10,3%).

В моче пациентов с ПМР (группы 1 и 2) обнаружено существенно больше (38) достоверных корреляционных связей, из них 44,7% — в группе 1, 55,3% — в группе 2 (табл. 2). Как и в моче здоровых детей, наблюдается доминирование аэробно-анаэробных (63,2%) взаимосвязей (группа 1 — 23,7%, группа 2 — 39,5%). Аэробно-аэробные корреляционные связи имели место в 29,0% случаев: группа 1 — 13,1%, группа 2 — 15,9%. Анаэробно-анаэробные (7,8%) были зарегистрированы в моче только пациентов группы 1.

Таким образом, у пациентов с ПМР достоверных корреляционных связей между различными таксонами микробиоты мочи больше, чем у здоровых детей, при доминировании аэробно-анаэробных взаимосвязей. Выявленные корреляционные взаимосвязи между микроорганизмами мочи здоровых детей и пациентов с ПМР являются уникальными. Как у здоровых детей, так и у детей с ПМР отсутствуют, как правило, достоверные связи между аналогичными таксонами. В моче здоровых детей и у пациентов с ПМР обнаружено только по одной достоверной взаимосвязи между аналогичными таксонами.

При анализе индивидуальных бактериограмм дисбиоз мочепузырной мочи выявлен в 65,0% случаев. Среди них в 40,0% наблюдений имели место изменения со стороны спектра микробов, то есть появление в моче микроорганизмов, не свойственных здоровым детям. А у 25,0% детей обнаружены повышенные относительно нормы уровни бактериурии. Дисбиоз оказался более характерен для девочек (61,5%), чем для мальчиков (38,5%).

Обсуждение

Первичный ПМР может осложняться ИМП у детей любого возраста. С другой стороны, рецидивирующие ИМП нередко обусловливают развитие вторичного ПМР. Так или иначе, ПМР и ИМП являются взаимообусловленными заболеваниями [3][4].

В этой связи продолжают обсуждаться различные аспекты ИМП: эффективность антибиотикопрофилактики при стерильном ПМР [10][15], риски развития ИМП при мониторировании стерильного ПМР [16], выбор антибиотика при эмпирическом лечении симптомной ИМП, в том числе при остром пиелонефрите [5][17], и так далее. При этом в одних исследованиях обосновываются необходимость и целесообразность непрерывной пролонгированной антибиотикопрофилактики [9][10], в других — отрицаются [10][18] или ставятся под сомнение [1][4][19][20]. Вместе с тем подчёркиваются негативные последствия антибиотикопрофилактики в виде дисбиоза кишечного микробиома и культивирования в моче штаммов микроорганизмов с высокой антибиотикорезистентностью [7][12][15][21].

В этой связи подчёркивается необходимость разработки индивидуальных подходов к использованию АБП и оценки рисков рецидивов ИМП [20][22].

Итак, выявление инфекционного фактора при наличии ПМР является краеугольным камнем в выборе тактики ведения ребёнка [23][24]. Бактериологическое исследование мочи в этих случаях является основополагающим методическим подходом [8]. Но стандартные питательные среды нацелены на выявление довольно узкого круга уропатогенов. Это представители порядка Enterobacterales, энтерококки и несколько таксонов грампозитивной микробиоты [25][26].

Вместе с тем уже более десяти лет хорошо известно, что мочепузырная моча здоровых людей, в том числе детей различных возрастных групп, содержит широкий спектр аэробных и анаэробных бактерий [26], которые обладают рядом патогенных свойств при полном благополучии макроорганизма.

В связи с этим наше исследование было нацелено на выявление микробиоты мочепузырной мочи перед предстоящим хирургическим вмешательством по поводу ПМР у детей. Исследование выявило нестерильность мочи во всех 40 изученных случаях. При этом в моче доминировали вовсе не бактерии из порядка Enterobacterales и энтерококки, а коагулазоотрицательные стафилококки, коринебактерии, анаэробы. Спектр микробиоты мальчиков и девочек имел чёткие гендерные характеристики. Сравнение микробиоты мочи детей с ПМР и здоровых детей позволило обнаружить ряд достоверных отличий как по спектру микробиоты, так и по уровням бактериурии некоторых представителей аэробов и анаэробов. Потенциальные уропатогены в моче мальчиков и девочек имели достоверные и оригинальные взаимосвязи между собой в ассоциациях.

Важно обратить внимание на то, что подавляющее большинство таксонов микробиоты мочи у мальчиков и девочек имело уровень бактериурии 10² КОЕ/мл, который не выявляется при стандартном бактериологическом анализе. Тем не менее хорошо известно, что аэробы и анаэробы при бактериурии 10² КОЕ/мл способны вызывать острый пиелонефрит при обструкции верхних мочевых путей [27].

Таким образом, наше исследование вносит ценную информацию о том, что эндоскопическое лечение ПМР у детей происходит в условиях бактериальной обсеменённости мочи различными вариантами микробных ассоциаций, в основном аэробно-анаэробных. Данный факт важен и с той точки зрения, что более чем в 60% случаев у детей перед операцией имеется дисбиоз мочепузырной мочи.

Такая ситуация является тревожной, имея в виду возможные риски инфекционно-воспалительных осложнений после хирургии ПМР и при дальнейшем мониторинге больных.

И все-таки остаётся неясным вопрос о том, каково клиническое значение новых знаний о микробиоте мочи при хирургическом лечении ПМР. Хочется надеяться, что дальнейшие исследования позволят сформулировать доказательства необходимости селективной антибиотикопрофилактики в проблеме ПМР: когда, кому и какая АБП.

Заключение

Мочепузырная моча у детей с ПМР характеризуется как нестерильная среда с присутствием в ней широкого ряда аэробных и анаэробных таксонов. Являются ли ассоциации бактерий при бактериурии 10² КОЕ/мл фактором риска ИМП при хирургии ПМР, предстоит ещё выяснить. Бесспорно, что дисбиоз мочепузырной мочи перед оперативным вмешательством следует изучать в будущем как фактор риска ИМП.