Рак предстательной железы (РПЖ) занимает лидирующие позиции в статистике онкологической заболеваемости среди мужчин [1]. Клиническое течение заболевания в каждом случае имеет индивидуальный характер, так как определяется уникальным сочетанием генетических, эпигенетических и морфологических особенностей клеток опухоли [2]. С целью оптимизации режима терапии разработаны и активно применяются в клинической практике критерии стратификации пациентов на группы разной степени риска [3]. На момент выявления заболевания к группе высокого риска относятся от 10 до 30% пациентов, в отношении которых оправдана активная лечебная тактика. В частности, проведение нео-адьювантной терапии может улучшить результаты радикальной простатэктомии в случаях местно-распространённого процесса [4]. В обзорной статье N. Mikkilineni  et al. (2018) представлен анализ различных режимов нео-адьювантной терапии, протестированных в рамках клинических испытаний [5], но различный дизайн исследований затрудняет сопоставление результатов и выбор оптимального подхода. Поэтому задача разработки эффективных режимов системной терапии для пациентов с РПЖ высокого риска (РПЖ-ВР) сохраняет актуальность.

В период за 2014–2018 годы в «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» было проведено исследование с целью оценки безопасности и эффективности нео-адьювантной химиогормональной терапии (ХГТ), выполненной перед радикальной простатэктомией (РП), у пациентов с РПЖ-ВР [6]. ХГТ предполагала сочетание двух препаратов: ингибитора деполяризации микротрубочек (доцетаксела) и антагониста гонадотропин-релизинг-гормона (дегареликса). В рамках исследования было проведено сравнение двух рандомизированных групп: пациентов, получавших курс нео-адьювантной терапии с последующим выполнением радикальной простатэктомии (ХГТ-РП), и пациентов, перенёсших только радикальную простатэктомию (РП). Пациенты первой группы хорошо переносили ХГТ, у них была выявлена меньшая степень локальной распространённости опухоли и большая 3-летняя общая выживаемость. Авторы сделали вывод о безопасности и эффективности режима ХГТ-РП у пациентов с РПЖ-ВР. Но для дальнейшей оптимизации терапевтических подходов в отношении пациентов с РПЖ-ВР необходимо углублённое изучение механизмов действия используемых лекарственных средств. Например, идентификация молекулярных маркеров чувствительности к таксанам и/или молекулярных мишеней модификации этой чувствительности может лежать в основе разработки методов более аккуратной стратификации пациентов или технологий повышения эффективности терапии.

МикроРНК — короткие регуляторные молекулы РНК, которые участвуют в формировании реакции клеток опухоли на действие цитостатических препаратов, включая таксаны [7]. Впервые участие ряда молекул микроРНК в формировании резистентности клеток РПЖ к действию таксанов было показано в 2015 году [8]. В ряде последующих экспериментальных работ была показана ассоциация уровня экспрессии ряда молекул (miR-200b-3p, miR-34b-3p and miR-375) со степенью устойчивости клеток РПЖ к действию паклитаксела. [9], что указывает на прогностический потенциал методов анализа этих молекул в биопсийном материале. Кроме того, терапевтическая модификация концентрации отдельных молекул (miR-323) является потенциальной технологией повышения чувствительности клеток РПЖ к воздействию доцетаксела [10].

Цель исследования: поиск молекул микроРНК, экспрессия которых ассоциирована с реакцией клеток РПЖ на воздействие таксанов в ходе ХГТ. В рамках работы был проведён сравнительный анализ ряда молекул микроРНК в материале РПЖ пациентов, получавших и не получавших нео-адьювантную ХГТ (ХГТ-РП vs РП) [6] и оценка изменения экспрессии этих молекул в клетках РПЖ после воздействию паклитаксела в условиях in vitro эксперимента.

Характеристики пациентов. В исследовании был использован послеоперационный материал от 56 пациентов с диагнозом РПЖ-ВР, включённых в ранее цитированное исследование [6]. В группу ХГТ-РП вошли 32 пациента, которым проводилась терапия препаратом доцетаксел один раз в 21 день (75 мг/м2 до 6 циклов) и антагонистом гонадотропин рилизинг-гормона дегареликс по стандартной схеме (6 подкожных введений каждые 28 дней) с последующей РП. В группу РП вошли 24 пациента, которым было проведено хирургическое лечение в качестве монотерапии. Клинические характеристики пациентов и результаты оценки эффекта терапии (ХГТ-РП vs. РП) представлены ранее [6]. Из фиксированных формалином парафинизированных образцов операционного материала были подготовлены срезы, содержащие клетки рака предстательной железы (> 90%).

Линии клеток РПЖ. В исследовании были использованы три линии клеток рака предстательной железы: LNCap, PC-3 и DU-145. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и смеси антибиотиков Пен-Стреп, 100 мкг/мл (ООО «Биолот», Санкт-Петербург, РФ) в стандартных условиях. Для оценки эффекта паклитаксела клетки выращивали в 6-луночном планшете до конфлюентности 50 – 60%, затем заменяли стандартную культуральую среду на среду с паклитакселом (Paclitaxel CAS № 33069-62-4 — «Sigma Aldrich» GmbH, Germany) в концентрации 10 нМ и 20 нМ и культивировали в течение 48 часов.

Выделение РНК. Выделение РНК из парафиновых срезов проводили с помощью набора miRNeasy FFPE Kit («Qiagen» GmbH, Hilden, Germany) согласно протоколу производителя. Выделение РНК из клеточных линий проводили с помощью набора реагентов LRU-100-50 (ООО «Биолабмикс», Новосибирск, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. Качество выделенной РНК оценивали на спектрофотометре NanoPhotometr N50 («Implen» GmbH, München, Germany), измеряя поглощение при длинах волн 260 и 280 нм. Концентрацию выделенной РНК оценивали на флуориметре Qubit 2.0 («Invitrogen» Corp., Carlsbad, CA, USA).

Оценка экспрессии микроРНК. Первоначальный анализ экспрессии 84 молекул онкогенных микроРНК (так называемых, cancer-associated miRNA) проводили с помощью набора реагентов «miRCURY LNA miRNA Focus PCR Panel – Human Cancer» («Qiagen» GmbH, Hilden, Germany). Дополнительно использовали наборы miRCURY LNA RT Kit, miRCURY LNA SYBR® Green PCR Kit («Qiagen» GmbH, Hilden, Germany) в соответствии с инструкцией производителя. Оценку экспрессии отдельных микроРНК проводили с использованием наборов серии ALL–MIR (ООО «Альгимед Техно», Минск, Беларусь). Все исследования выполняли на приборе Real-Time CFX96 Touch instrument («Bio-Rad Laboratories», Inc., Hercules, CA, USA).

Статистический анализ. Расчёт изменений экспрессии отдельных молекул микроРНК выполняли методом dCt (delta Cycle threshold), при этом в качестве нормализатора использовали среднее значение Ct всех анализируемых молекул в отдельном образце (так называемое значение total Ct) по формуле dCt = 2(total Ct – Ct miR-93. Данные были проверены на нормальность распределения с помощью тестов Колмогорова-Смирнова и Shapiro-Wilk. Для оценки статистической значимости разницы уровня экспрессии отдельных молекул между сравниваемыми группами пациентов проводили вычисления непараметрического критерия Mann-Whitney U test. Для оценки статистической значимости разницы уровней экспрессии отдельных молекул в клетках РПЖ после воздействия паклитаксела проводили расчёт среднеарифметических значений нормализованных показателей и среднеквадратичного отклонения по формуле: STD = √(∑(х – хaverage)2)/n. Cбор, распределение и анализ данных осуществляли с помощью программ CFX Manager™ Software («Bio-Rad Laboratories», Inc., Hercules, CA, USA), Microsoft Office Excel 10.0 («Microsoft» Corp., Redmond, WA, USA), Sigma Plot 11.0 («Systat Software», Inc., San Jose, CA, USA), GraphPad Prism 8.0 («GraphPad Software» Inc., Graphpad Holdings LLC, San Diego, CA, USA).

Поиск регулируемых молекул микроРНК. Работа была имела три этапа, которые схематично представлены на рисунке 1.

Задачей первого этапа был относительно «широкий профайлинг» относительно большого числа потенциально маркерных молекул. Для этого из двух групп образцов РНК приготовили так называемые «РНК-пулы» (ПЭ и ХГТ-РП). Каждый такой «РНК-пул» представлял собой эквимолярную смесь образцов РНК одной группы сравнения. Суммарный профиль экспрессии 84 молекул микроРНК был проведён в каждом «РНК-пуле». Обработка полученных данных об экспрессии 84 микроРНК включала проверку эффективности выделения РНК, меж-планшетную калибровку, нормализацию относительно среднего арифметического значения (total Ct). Из анализа были исключены микроРНК, значения Ct для которых составило больше 38. Из анализа исключили молекулы, для которых значения нормализованных показателей уровня экспрессии для двух «РНК-пулов» отличались менее чем полтора раза. Таким образом, были выбраны 29 молекул. Анализ научной литературы показал, что связь между уровнем экспрессии и воздействием паклитаксела на опухолевые клетки была ранее показана для 12 из 29 выбранных микроРНК. Перечень потенциально маркерных молекул и соответствующие ссылки на источники представлены в таблице.

Анализ экспрессии потенциально маркерных микроРНК. Для оценки (валидации) дифференциальной экспрессии 12 выбранных микроРНК в 56 образцах операционного материала была использована технология двустороннего праймирования обратной транскрипции с последующей ПЦР с двумя микроРНК-специфичными праймерами (рис. 1; этап 2). В этом случае анализ 12 молекул был проведён для каждого образца, результаты нормализованы, произведён расчёт средних значений для сравниваемых групп (табл.). С помощью Mann-Whitney U test установлено, что ожидаемые различия экспрессии микроРНК между исследуемыми группами пациентов наблюдались для всех 12 молекул, но эти различия имели разную степень статистической значимости (табл. 1).

На рисунке 2 представлены результаты сопоставления показателей относительной (нормализованный) экспрессии молекул, с наибольшей разницей между сравниваемыми группами. Так, в большинстве случаев в клетках РПЖ пациентов группы ХГТ-РП наблюдалось повышенная экспрессия анализируемых молекул, включая miR-200c, miR-143, miR-375, miR-200b, miR-27a по сравнению с контрольной группой (РП). Лишь для одной молекулы (miR-106b) было выявлено статистически значимое снижение экспрессии в группе ХГТ-РП. Так как режим нео-адьювантной терапии пациентов экспериментальной группы включал два препарата (доцетаксел и дегареликс), полученные результаты не позволяют сделать вывод о том, какой именно препарат послужил триггером изменения экспрессии молекул микроРНК. Но представленные данные указывают на очевидное влияние, которое оказывает использованное сочетание препаратов на экспрессию ряда молекул микроРНК в клетках РПЖ.

Анализ влияния паклитаксела на экспрессию микроРНК в клетках РПЖ in vitro. Исследованная схема ХГТ [6] предполагала сочетание двух препаратов различного механизма действия. Доцетаксел действовал непосредственно на клетки опухоли, изменяя динамику деполимеризации микротрубочек и блокируя процесс митоза [21]. Дегареликс, селективный антагонист гонадотропин-релизинг гормона, конкурентно связывал гипофизарные рецепторы, снижал секрецию гонадотропных гормонов гипофизом и, как следствие, тестостерона — гонадами [22]. Таким образом, действие дегареликса определялось преимущественно снижением стимулирующего влияния тестостерона на клетки опухоли, и возможные изменения экспрессии клеточных микроРНК могли быть результатом этого эффекта. Условия in vitro эксперимента позволяют дифференцировать цитостатические эффекты таксанов и дефицита тестостерона. В рамках данного исследования стояла задача оценить, какие из наблюдаемых в условиях in vivo изменений экспрессии микроРНК опосредованы действием таксанов. Для этого были использованы три линии клеток РПЖ: PC-3 и DU145 (андроген-зависимые) и LNCap (андроген-независимые) клетки. Клеточные линии культивировались в среде, содержащей паклитаксел в разных концентрациях, что позволяло оценить зависимость наблюдаемых эффектов от дозы. После 48 часов инкубации был проведён анализ экспрессии маркерных молекул микроРНК. В двух случаях наблюдались изменения, которые имели доза-зависимый характер и воспроизводились в трех культурах клеток. Так, паклитаксел активировал экспрессию miR-106b, но угнетал экспрессию miR-200c (рис. 3).

Зафиксированные изменения имели характер, аналогичный тому, что наблюдался в клетках РПЖ пациентов после проведения нео-адьювантной ХГТ. Таким образом, воздействие таксанов стимулирует экспрессионную активность miR-106b и угнетает экспрессионную активность miR-200c в клетках РПЖ в условиях in vivo и in vitro. Изменений экспрессионной активности других молекул микроРНК не наблюдалось, что позволяет предполагать, что изменение экспрессии этих молекул в клетках опухолей пациентов являлось результатом медикаментозной кастрации, а не результатом цитостатического действия доцетаксела.

В рамках представленного исследования решалась задача поиска и изучения изменений экспрессии микроРНК клетками РПЖ, вызванных сочетанным воздействием доцетаксела и дерагеликса. Анализ материала опухолей пациентов, перенёсших нео-адъювантную ХГТ, позволил выявить статистически значимые изменения экспрессии (преимущественно активацию) ряда молекул микроРНК. Выбор молекул, включённых в детальное исследование (рис. 1; этап 2), был основан на предварительных результатах анализа 85 опухоль-ассициированных микроРНК в «РНК-пулах» образов и данных литературы (рис. 1; этап 1). Поэтому велика вероятность того, что многие молекулы микроРНК, «ответившие» на воздействие ХГТ, остались за рамками исследования, а показанные изменения экспрессии 12 молекул являются лишь фрагментом изменений, вызванных ХГТ, в профиле экспрессии миркоРНК клетками РПЖ. Тем не менее, статистически значимые сдвиги экспрессионной активности ряда молекул микроРНК подтверждают факт воздействия ХГТ на биологию клеток РПЖ. Эти результаты хорошо сочетаются с данными раннее проведённой оценки показателей клинической эффективности нео-адьювантной ХГТ.

Интересным феноменом является преимущественно стимулирующий эффект, который оказала ХГТ на экспрессию микроРНК: из 12 включённых в исследование молекул активация экспрессии наблюдалась в 11 случаях, а угнетение экспрессии в группе ХГТ-РП наблюдалось лишь для miR-106b. Но для подтверждения и корректной интерпретации этого наблюдения необходим более «широкий» анализ, например, с использованием технологии секвенирования «нового поколения» (NGS, next generation sequencing).

Основным результатом заключительного in vitro этапа (рис. 1; этап 3) исследования явилось описание изменений экспрессии miR-106b и miR-200c в клетках РПЖ, индуцированных воздействием паклитаксела. Так, изменения экспрессии этих молекул в клетках РПЖ пациентов, получивших курс ХГТ, и в клетках трех линий (LNCap, PC-3, DU145) после воздействия паклитаксела, имели аналогичный характер. Это указывает на высокую вероятность участия miR-106b и miR-200c в реакции клеток РПЖ на воздействие таксанов. Интересно, что в недавнем обзоре исследований микроРНК в качестве терапевтических мишеней и маркеров РПЖ [23], итальянские авторы (N. Arrighetti и G.L. Beretta) также отметили разнонаправленный характер участия miR-106b и miR-200c в развитии РПЖ (рис. 4).

Так, «канцерогенный характер» miR-106b был показан в контексте развития различных онкологических заболеваний, включая гепатоцеллюлярную карциному [24], рак молочной железы [25] и РПЖ. Причём в последнем случае эффект miR-106b ассоциировался с регуляцией адгезивных характеристик [25] и метастатического потенциала клеток [26]. Можно предполагать, что противоопухолевый эффект таксанов при РПЖ выражен не только в непосредственном влиянии на динамику микротрубочек, но и ассоциирован с угнетением экспрессии miR-106b и снижением злокачественного потенциала клеток РПЖ.

В электронной библиотеке PubMed Национальных Американских Институтов Здоровья (NIH, National Institute of Health) содержится более 4000 научных статей, в которых отражена роль miR-200c в развитии РПЖ. Эти исследования описывают различные механизмы участия miR-200c в регуляции биологии клеток, но в большинстве случаев эта молекула рассматривается как «онкосуппрессор»: miRNA prostate guardian [27]. В этом контексте активация экспрессии miR-200c на фоне / в результате цитостатического действию таксанов представляется закономерным явлениям.

В заключение имеет смысл отметить, что из 12 молекул, исследованных в рамках двух первых этапов работы, для десяти наблюдалось отсутствие эффекта паклитаксела в условиях in vitro эксперимента. Поэтому можно предполагать, что причиной изменения экспрессии этих десяти молекул в клетках РПЖ пациентов послужила медикаментозная кастрация. Таким образом, в контексте как минимум 12 исследуемых молекул эффект снижения стимулирующего влияния тестостерона представляется более выраженным по сравнению с эффектов доцетаксела. Известно, что дегареликс оказывает непосредственное воздействие на клетки РПЖ [28]. Это воздействие затрагивает механизмы регуляции пролиферации, клеточной адгезии и программированной клеточной гибели, и может служить объяснением более значимого эффекта дегареликса (чем доцетаксела) на экспрессионный статус микроРНК клеток РПЖ, наблюдавшийся в рамках данной работы. Для более детального исследования этого феномена необходимо проведение дополнительных in vitro исследований и оценки изолированного воздействия дегареликса на линии клеток РПЖ.

Научный поиск возможностей и разработка эффективных и мульти-модальных методов терапии пациентов с раком предстательной железы высокого риска является нерешённой задачей. Эта группа пациентов требует активной терапевтической тактики, которая может быть реализована либо путём эффективного сочетания существующих методов (химиотерапия, гормонотерапия, иммунотерапия, лучевая терапия, хирургия), либо путём разработки и внедрения новых методов.

МикроРНК — эндогенные регуляторы многий клеточных процессов, эти молекулы активно участвуют в неопластической трансформации клеток и в реакции клеток рака предстательной железы на любые терапевтические воздействия [29]. Терапевтическая модификация состава миркоРНК в клетках опухоли является перспективной стратегией повышения эффективности стандартных методов терапии, как это, например, было доказано для сочетания miR-124 и паклитаксела [30]. Поэтому исследование участия этих молекул в формировании ответа на терапию рака предстательной железы высокого риска может создать основание для разработки инновационных лечебных технологий, особенно актуальных для этой группы пациентов.