Азооспермия, определяемая как отсутствие сперматозоидов в эякуляте, выявляется примерно у 1% мужского населения и у 10 – 15% бесплодных мужчин [1][2]. В отличие от обструктивной азооспермии, при которой имеется обструкция семявыносящих протоков, необструктивная азооспермия характеризуется полным отсутствием сперматозоидов в семенной жидкости из-за минимального сперматогенеза или его отсутствия. Мужчины с необструктивной азооспермией представляют собой наиболее сложную для лечения категорию бесплодных мужчин. По сравнению с фертильными мужчинами у них обычно повышен уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), снижен уровень общего тестостерона в сыворотке крови и уменьшен объём яичек. Чтобы инициировать биологическую беременность, им обычно требуется процедура экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ICSI) с использованием тестикулярных сперматозоидов, полученных хирургическим путём [3]. К сожалению, частота хирургической экстракции сперматозоидов у мужчин с необструктивной азооспермией остаётся низкой [4].

Гистопатологические диагнозы, основанные на биопсии яичек у мужчин с необструктивной азооспермией, включают Сертоли-клеточный синдром (SCO-синдром), гипосперматогенез и остановку созревания сперматозоидов, определяемых наличием половых клеток, не достигших полного созревания. Однородная остановка созревания сперматозоидов характеризуется остановкой сперматогенеза на одной и той же стадии во всех семенных канальцах [5]. Она подразделяется на раннюю, в которой обнаруживаются только сперматогонии или сперматоциты, и позднюю, в которой обнаруживаются сперматиды без сперматозоидов [6][7]. У некоторых мужчин с остановкой созревания сперматозоидов могут быть очаги сперматогенеза в яичках, и сперматозоиды, обнаруженные в этих локусах при microTESE, могут быть использованы для процедуры ЭКО/ICSI [5].

Остановка созревания сперматозоидов может быть первичной (генетической или идиопатической) или приобретённой. К приобретённым причинам относятся ятрогенные состояния (химиотерапия, лучевая терапия, лекарственная терапия и добавки тестостерона), перенесённые инфекции, эндокринопатии, врождённые аномалии (крипторхизм), перекрут яичка и варикоцеле [8]. У таких пациентов, как и у пациентов с обструктивной азооспермией, нормальный уровень сывороточных гормонов (ФСГ, лютеинизирующего гормона, тестостерона и пролактина) и объём яичек [9]. Но есть и противоречивые данные. Так T. Ishikawa et al. обнаружили, что у лиц с более поздними стадиями остановки созревания сперматозоидов был более низкий уровень ФСГ и больший диаметр семенных канальцев, чем у мужчин с более ранними стадиями [8]. Сообщалось также, что у пациентов c остановкой созревания сперматозоидов чаще выявляются генетические аномалии, такие как микроделеции Y-хромосомы и кариотипические аномалии [5][10][11][12].

A.J. Hung et al. сообщили, что у мужчин с однородной остановкой созревания сперматозоидов и нормальным ФСГ была более низкая частота хирургической экстракции сперматозоидов с помощью microTESE и худшие результаты ЭКО/ICSI, чем у других мужчин с необструктивной азооспермией [5]. Для мужчин с обструктивной азооспермией, например тех, кто ранее перенёс вазэктомию, частота хирургической экстракции сперматозоидов должна составлять практически 100% [13]. Однако несмотря на то, что прогнозы по номограмме, зависящие от размера яичек и уровня ФСГ в сыворотке, порой эффективны для дифференциации мужчин с необструктивной азооспермией и идиопатической обструктивной азооспермией, они не совсем точны [14]. Кроме того, у мужчин с гистологией остановки созревания сперматозоидов могут быть нормальный объём яичек и относительно более низкий уровень ФСГ по сравнению с другими гистологическими подтипами необструктивной азооспермией, что может затруднить дифференциальный диагноз с обструктивной азооспермией [15].

Таким образом маркер, позволяющий дифференцировать эти два состояния (обструктивную азооспермию и остановку созревания сперматозоидов), помог бы в прогнозировании успеха хирургических методов экстракции сперматозоидов и консультировании пациентов с мужским бесплодием. Потенциальным источником таких биомаркеров является семенная плазма.

Цель исследования: оценка липидомного профиля эякулята у пациентов с остановкой созревания сперматозоидов.

Изучен липидомный профиль семенной плазмы 64 пациентов с азооспермией и 24 здоровых мужчин с нормозооспермией в качестве группы контроля. Работа проведена в отделении андрологии и урологии НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. Кулакова (Москва, Россия) в 2019 – 2021 годах. Исследование одобрено локальным этическим комитетом Сеченовского университета (Москва, Россия). Все пациенты дали письменное согласие на участие в исследовании.

В исследуемую группу были включены мужчины старше 18 лет с азооспермией, подтверждённой дважды при анализе семенной жидкости. Критерии исключения: инфекционные заболевания (острые и хронические в стадии обострения), ретроградная эякуляци и анэякуляция. Всем 64 мужчинам была проведена процедура microTESE, которая выполнялась в соответствии со стандартными протоколами, описанными A.A. Dabaja и P.N. Schlegel [16], с последующим патоморфологическим исследованием биоптатов яичка. В данном исследовании оценивали липидомный профиль семенной плазмы мужчин с необструктивной азооспермией, в том числе с гистологией остановки созревания сперматозоидов.

Липиды из семенной плазы выделяли методом экстракции Фолча. Липидные экстракты и образцы контроля качества анализировали на жидкостном хроматографе по описанной ранее методике авторами [17]. Липиды идентифицировали с использованием R-скрипта Lipid Match1 по точной массе с помощью базы данных Lipid Maps2 и по характерным тандемным масс-спектрам (МС/МС).

Методы статистического анализа. Для статистической обработки результатов использовали скрипты, написанные на языке R3 и программу RStudio4 (RStudio PBC, США). Перед исследованием данные были нормированы на медианные значения соответствующих пиков в образцах контроля качества. При сравнении групп «контроль» и «азооспермия с остановкой созревания сперматозоидов» использовали тест Манна-Уитни. Для сравнения липидных профилей эякулята до и после операции применяли критерий Уилкоксона. Для описания количественных данных использовали медиану (Me) и квартили Q1 и Q3. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05.

Выбор переменных для построения диагностических моделей на основе логистической регрессии «контроль» / «остановка созревания сперматозоидов» осуществляли двухступенчатым методом: с использованием дискриминантного анализа ортогональными проекциями проекций переменных на скрытые структуры (OPLS-DA) определяли значения проекций переменных (ПП) и выбирали те, которые удовлетворяли условию ПП > 1. Из них переменные отбирали пошагово, опираясь на значение информационного критерия Акаике (ИКА). Когда рост ИКА останавливался, из выбранного набора соединений пошагово исключали те, чьи коэффициенты не отличались статистически значимо от 0 (порог значимости — 0,05). Полученные модели валидировали с использованием кросс-валидации по отдельному объекту.

У 25 из 64 пациентов после микродиссекционной биопсии яичка были обнаружены сперматозоиды. У 14 из 64 пациентов была патоморфологическая картина остановки созревания сперматозоидов и у всех оказался отрицательный исход microTESE.

При сравнении группы контроля и группы с остановкой созревания сперматозоидов были выбраны как статистически значимые 22 липида в режиме положительных ионов (табл. 1) и 11 липидов в режиме отрицательных ионов (табл. 2). Липиды относятся преимущественно к классам гексозилцерамидов, сфингомиелинов и фосфотидилхолинов — простых эфиров и окисленных липидов.

Были построены диагностические модели на основе логистической регрессии для определения остановки созревания сперматозоидов в режиме положительных и отрицательных ионов (табл. 3 – 4, рис. 1).

Модель в режиме положительных ионов по результатам кросс-валидации обладала более благоприятными прогностическими характеристиками, а именно хорошей чувствительностью (91%) и удовлетворительной специфичностью (85%). В режиме отрицательных ионов по результатам кросс-валидации модель обладала менее благоприятными прогностическими характеристиками, а именно удовлетворительной чувствительностью (75%) и специфичностью (81%).

При консультировании по поводу бесплодия для пациентов с необструктивной азооспермией важно предоставить информацию о шансах получения сперматозоидов. Неудачная процедура microTESE, особенно при одновременном заборе яйцеклетки, может иметь непоправимые эмоциональные и финансовые последствия для обоих членов семейной пары [18]. В соответствии с более ранними исследованиями использование гистопатологических паттернов можно рассматривать как ценный предиктор экстракции сперматозоидов [15][19][20].

В нашем исследования мы оценивали липидомный профиль эякулята у пациентов с остановкой созревания сперматозоидов. Нам удалось найти липиды-кандидаты, в том числе PC 16:0_22:6, PC O-16:1/16:0, SM d20:1/22:2 и PG 20:3_22:6, относящиеся к классам фосфотидилхолинов, сфингомиелинов (фосфолипиды) и фосфатидилглицеринов, которые при многофакторном анализе оказались статистически значимыми предикторами необструктивной азооспермии с остановкой созревания сперматозоидов.

F. Sicchieri et al. выявили, что при размораживании криоконсервированных сперматозоидов их общая подвижность значительно увеличилась после обработки Lα-фосфатидилхолином и L-ацетил-карнитином [21]. Также A.A. Vireque et al. в своём исследовании продемонстрировали, что Lα-фосфатидилхолин in vitro улучшает качество сперматозоидов [22]. M. Boguenet et al. проанализировали метаболомный профиль семенной плазмы 20 мужчин с тяжёлой олигоастенозооспермией и сравнили их с 20 мужчинами с нормозооспермией, выявив снижение концентраций 17 фосфатидилхолинов и 4 сфингомиелинов в группе с тяжёлой олигоастенозооспермией [23].

Сфингомиелины являются компонентами простасом, которые при слиянии со сперматозоидами стабилизируют их плазматическую мембрану, обогащая её холестерином, сфингомиелином и насыщенным глицерофосфолипидом. Это предотвращает преждевременное возникновение акросомной реакции [24]. R. Rivera-Egea et al. проанализировали липидный состав сперматозоидов от бесплодных пациентов после интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (группа незабеременевших (n  = 16) по сравнению с группой забеременевших (n  = 22)) и обнаружили 151 различных липидов в образцах, 10 из которых были значительно увеличены в образцах из группы незабеременевших, в пределах от 1,10 до 1,30 раза. В первую очередь это были церамиды, сфингомиелины и три глицерофосфолипида, один лизофосфатидилхолин и два вида плазмалогенов [25].

Обсуждая недостатки исследования, мы не можем не затронуть выбор контрольной группы. Нормозооспермия явно будет отличаться от любой азооспермии по метаболомному профилю ввиду отсутствия сперматозоидов. Это и является недостатком нашей работы. Мы решили, что использовать обструктивную азооспермию в качестве группы контроля мы не можем, ввиду того что липидом будет зависеть от уровня обструкции. С учётом гетерогенность необструктивной азооспермии эта группа также не подходит. Использовать отдельные подвиды необструктивной азооспермии в качестве группы сравнения тоже сомнительно, так как метаболомный профиль ранее у них подробно не описывался. Это исследование является первым из такой серии. Нами было принято решение использовать в качестве контрольной группы нормозооспермию. Искажение результатов из-за влияния зрелых сперматозоидов мы нивелировали, исследуя отделённую от них семенную плазму. В будущем нами планируется сравнение метаболомного профиля семенной плазмы подвидов необструктивной азооспермии.

Несмотря на то, что и у фертильных мужчин, и у мужчин с гомогенной остановкой созревания сперматозоидов в равной мере сохранены ранние этапы сперматогенеза, эякулят у исследуемой группы пациентов отличается по своему липидному профилю. Пациенты с необструктивной азооспермией, в частности на фоне остановки мейоза, могут иметь уникальные липидомные характеристики семенной плазмы, которые, возможно, в будущем позволят дифференцировать различные варианты тяжёлого мужского бесплодия с помощью неинвазивных методов.

1. Koelmel JP, Kroeger NM, Ulmer CZ, Bowden JA, Patterson RE, Cochran JA, Beecher CWW, Garrett TJ, Yost RA. LipidMatch: an automated workflow for rule-based lipid identification using untargeted high-resolution tandem mass spectrometry data. BMC Bioinformatics. 2017;18(1):331. DOI: 10.1186/s12859-017-1744-3 2. Sud M, Fahy E, Cotter D, Brown A, Dennis EA, Glass CK, Merrill AH Jr, Murphy RC, Raetz CR, Russell DW, Subramaniam S. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Res. 2007;35(Database issue):D527-32. DOI: 10.1093/nar/gkl838 3. Team, R.C. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Available online: https://www.r-project.org/ 4. Team, Rs. RStudio: Integrated Development for R. Available online: http://www.rstudio.com/