В настоящее время существует множество экономически эффективных методов лечения бесплодия у женщин, однако при мужском бесплодии возможности успешного лечения ограничены [1][2][3]. В мире от бесплодия страдает 12 – 15% супружеских пар, то есть эта проблема является глобальной и затрагивает, по некоторым оценкам, до 90 миллионов человек [4][5]. В России число мужчин с бесплодием за последние 20 лет увеличилось более, чем в 2 раза [6]. Согласно данным большинства исследований, мужской фактор выступает причиной бесплодия в половине и более случаев [7][8].

Исходя из ведущей роли окислительного стресса в развитии мужского бесплодия для улучшения качества спермы наиболее часто применяется эмпирическая терапия различными антиоксидантами [9][10][11][12]. Центральным механизмом действия комплекса микронутриентов подобного типа называется нормализация баланса про- и антиоксидантных систем эякулята без достаточного теоретического/экспериментального обоснования выбора комбинаций препаратов, их дозировок, режима назначения и дизайна исследования. Относительно низкая эффективность коррекции мужского бесплодия объясняется почти исключительно малой выборкой пациентов (недостаточной мощностью исследования) и т.п. При этом игнорируется то обстоятельство, что нормальное функционирование сперматозоидов, как и других живых клеток, возможно лишь в узком диапазоне значений окислительно-восстановительного статуса, который может быть сравнительно легко разбалансирован при назначении антиоксидантов в неадекватных дозах [13][14]. В связи с этим в настоящей работе была предпринята попытка анализа некоторых сторон влияния антиоксидантных соединений на свободнорадикальные явления in vitro в диапазоне концентраций, близких к их содержанию в семенной плазме мужчин [15].

Цель исследования: Cравнить антиокислительную активность препаратов на основе L-карнитина для лечения мужского бесплодия в эксперименте на модельных системах.

В работе были использованы препараты на основе L-карнитина — «АндроДоз®» (АО «Нижфарм», Россия) и «Проксид® плюс» (Sigma-Tau Pharmaceuticals Inc., Италия), которые применяются с целью нормализации параметров спермы при идиопатическом бесплодии [13][16].

Одна капсула «АндроДоз®» содержит 180 мг L-аргинина, 60 мг L-карнитина, 23 мг L-карнозина, 2,5 мг коэнзима Q10, 1,5 мг глицирризиновой кислоты, 1,2 мг цинка, 0,8 мг витамина Е, 0,09 мг витамина А, 8,5 мкг селена. Суточный приём — 4 капсулы, что соответствует 12 – 80% рекомендуемого уровня их суточного потребления.

Одно саше «Проксид® плюс» содержит 1000 мг L-карнитина, 500 мг ацетил-L-карнитина, 50 мкг селена, 20 мг коэнзима Q10, 1000 мг фруктозы, 50 мг лимонной кислоты, 10 мг цинка, 90 мг аскорбиновой кислоты, 200 мкг фолиевой кислоты, 1,5 мкг витамина B12. Суточный приём — 2 саше, что соответствует или выше рекомендуемого уровня суточного потребления.

Важнейшим компонентом обеих комбинаций является L-карнитин. Кроме того, оба состава включают коэнзим Q10, селен, цинк, другие же ингредиенты отличаются. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что содержание этих четырёх основных соединений в пересчёте на суточную дозу в «Проксид® плюс» намного больше, чем в «АндроДоз®»: по карнитину — в 12 раз, по коэнзиму Q10 и цинку — в 4 раза, по селену — в 3 раза.

Интенсивность свободнорадикальных процессов и антиокислительную активность биологически активных добавок определяли методом регистрации хемилюминесценции (ХЛ) в модельных системах, генерирующих активные формы кислорода (АФК) с использованием хемилюминометра LKB-Wallac 1256 (Wallac Oy/PerkinElmer®, Финляндия). Количественно ХЛ оценивали по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК. Антиокислительную активность препаратов в биологической среде тестировали при их добавлении к липидам куриного желтка, аналогичным липопротеиновым комплексам крови.

«АндроДоз®» растворяли в бидистиллированной воде до концентрации карнитина 0,65 мг/мл, то есть таким образом, чтобы его конечная концентрация в среде инкубации соответствовала физиологическому уровню в спермоплазме [15]. «Проксид® плюс» разводили до концентрации карнитина в 2,8 раза большей, то есть соответствующей превышению его содержания в суточной дозе по сравнению с «АндроДоз®».

Методы статистического анализа. Для статистической обработки использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0 for Windows (StatSoft Inc., CША). Данные обработаны непараметрическими методами и представлены в виде средней арифметической величины (M) и стандартной ошибки средней арифметической (m). Различия изучали с использованием U-теста Манна–Уитни. Достоверными считали результаты при уровне значимости p ≤ 0,05.

На рисунке 1 приведены результаты сравнительного анализа препаратов в модельной системе in vitro, генерирующей АФК. Представленные данные свидетельствуют о достаточно высокой антиоксидантной активности препаратов. Добавление «АндроДоз®» и «Проксид® плюс» в инкубационную среду в количестве, сопоставимом по содержанию карнитина с его физиологическим уровнем в семенной плазме, значительно угнетало свечение модельной системы. Степень подавления генерации АФК существенно отличалась: если «Проксид® плюс» практически полностью блокировал процессы радикалообразования, то «АндроДоз®» в эквивалентной дозе снижал интенсивность свечения на 60%.

Близкие результаты были получены при исследовании активности препаратов с помощью второй тест-системы, которая позволяет оценить их действие на интенсивность процессов перекисного окисления липидов. С этой целью «АндроДоз®» и «Проксид® плюс» добавляли к липидам куриного желтка, сходным по составу с липидами крови.

Из представленных записей хемилюминограмм следует, что показатели медленной вспышки заметно уменьшаются при добавлении в модельную систему «АндроДоз®» и «Проксид® плюс» (рис. 2), то есть антиокислительные свойства этих препаратов проявляются и в биологической среде.

Результаты определения светосуммы свечения (полный выход зарегистрированного излучения) как интегрального параметра интенсивности хемилюминесценции и другие показатели люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) представлены в таблице.

Анализ общей антиокислительной активности позволил выявить статистически значимые различия между значениями светосуммы, которые при добавлении «АндроДоз®» и «Проксид® плюс» уменьшались, соответственно, на 26 и 38 %. Существуют доказательства, что величина светосуммы ХЛ отражает потенциальную способность клеточных липидов вступать в реакции окисления [17]. Исходя из этого, правомерно мнение о протективном действии данных биологически активных добавок в отношении биологических мембран.

Пропорционально светосумме при добавлении препаратов снижается также индекс максимальной светимости, что косвенно свидетельствует об увеличении антиокислительной ёмкости модельной системы. На основании этих данных можно предположить, что использованные в настоящей работе комплексы биологически активных веществ при применении in vivo потенциально способны модулировать свойства семенной жидкости благодаря повышению уровня суммарной антиокислительной активности.

Одним из основных показаний для антиоксидантной терапии является идиопатическая форма мужского бесплодия, исходя из постулата о ведущей роли окислительного стресса в генезе нарушений оплодотворяющей способности сперматозоидов. Мужское бесплодие, в целом, является едва не самой частой патологией, при которой назначаются антиоксиданты.

По данным последнего кокрейновского метаанализа, результаты такого лечения не всегда удовлетворительны и не поддаются однозначной интерпретации [18]. В работу было включено 61 исследование, в которых приняли участие 6264 бесплодных мужчины в возрасте от 18 до 65 лет. Всего было использовано 18 различных пероральных антиоксидантов. Авторами представлены доказательства «низкого» или «очень низкого» качества о том, что добавление антиоксидантов у субфертильных пациентов может незначительно улучшить показатели живорождения и частоту клинических беременностей у пар, посещающих клиники по лечению бесплодия. Вместе с тем, при исключении из анализа исследований с систематическими ошибками феномен увеличения живорождений не был подтверждён. В заключении авторы настоятельно советуют информировать супружеские пары о том, что текущие данные об эффективности антиоксидантов являются неубедительными вследствие некорректной отчётности о методах рандомизации, отсутствия данных об исходах клинической беременности, часто неясного или высокого отсева пациентов, а также погрешностей в результатах исследования из-за низкой частоты наступления беременности и рождения живого ребёнка и небольших размеров выборки. В обзоре также содержится ставшая уже дежурной в подобного рода сообщениях рекомендация проведения масштабных хорошо спланированных рандомизированных плацебо-контролируемых исследований для уточнения роли и места антиоксидантов в комплексной терапии мужского бесплодия.

Существуют и другие мнения о сложившейся в современной андрологии ситуации с применением антиоксидантов. Согласно одной из них, возможно развитие так называемого «антиоксидантного парадокса», когда введение больших доз антиоксидантов сопровождается незначительным или нулевым профилактическим/лечебным эффектом, что может быть обусловлено резистентностью эндогенных редокс-систем к высоким дозам пищевых антиоксидантов [14, 19]. С этих позиций регулирование уровней эндогенных антиоксидантов (например, путём введения слабых прооксидантов) может быть более полезным подходом к лечению и профилактике инфертильности, чем потребление больших доз антиоксидантов.

Показательны результаты свежего глобального опроса 1327 специалистов в области репродукции для определения клинической полезности тестирования на оксидативный стресс и назначения антиоксидантов для лечения мужского бесплодия [20]. Как выяснилось, почти 86 % андрологов регулярно назначают антиоксиданты на срок от 3 до 6 месяцев, тогда как две трети опрошенных не проводят никаких тестов на наличие оксидативного стресса, то есть имеет место практически бесконтрольная терапия. При этом, только 19,7% специалистов признали убедительными доказательства, подтверждающие необходимость использования антиоксидантов, в то время как 22,2% сочли их бесполезными, а большинство (52,3%) нашли их скромными.

Ранее нами было продемонстрировано, что эмпирическая антиоксидантная терапия способна привести к истощению физиологических уровней АФК и развитию гипервосстановленного состояния основных редокс-систем эякулята, то есть явлений редуктивного стресса как зеркального отражения окислительного стресса с аналогичными негативными последствиями для детородной функции [3]. На базе этих данных была сформулирована концепция управляемой пероксидации и адекватной контролируемой терапии окислительного стресса, согласно которой применение антиоксидантов, а также корректировка дозы и режима их назначения должны сопровождаться обязательным динамическим мониторингом спермограммы и окислительно-восстановительного статуса семенной плазмы. Аппаратные возможности для экспресс-диагностики редокс-состояния эякулята появились сравнительно недавно с разработкой системы MiOXSYS (Male Infertility Oxidative Stress System), с помощью которой проводится быстрая объективная оценка окислительно-восстановительного баланса при мужском бесплодии [21].

Как следует из настоящего исследования, необходимо также предварительное тестирование антиоксидантных характеристик препаратов in vitro для выбора оптимального подхода к их назначению и профилактике осложнений в виде редуктивного стресса.

В результате проведённых нами исследований установлено, что комплексные препараты обладают высокой способностью к нейтрализации свободных радикалов в модельных условиях. Антиоксидантные эффекты «АндроДоз®» и «Проксид® плюс» обусловлены, в первую очередь, компонентами, непосредственно влияющими на определенные звенья патогенеза окислительного стресса, которые подробно описаны в научной литературе. Обе биологически активные добавки нашли применение в андрологической практике, в ряде исследований констатировано повышение объёма эякулята, прогрессивной подвижности и жизнеспособности сперматозоидов, а также снижение индекса фрагментации ДНК [11][16]. В то же время в этих работах не было представлено данных об увеличении частоты наступления беременности и рождения живого ребёнка на фоне и после лечения, а также сведений о степени проявления у пациентов оксидативного стресса.

В настоящем исследовании in vitro подтверждён высокий антиоксидантный потенциал многокомпонентных комбинированных составов на основе карнитина, витаминов и микроэлементов. В эквивалентных по карнитину дозах установлено более выраженное ингибирующее влияние препарата «Проксид® плюс» вплоть до полного подавления липопероксидации, что может индуцировать дефицит свободных радикалов, необходимых для нормального обеспечения жизненно важных процессов. Умеренные эффекты «АндроДоз®» обусловлены, очевидно, меньшим содержанием биологически активных ингредиентов и более сбалансированным составом, что снижает риски развития осложнений в виде «антиоксидантного парадокса» или редуктивного стресса.