Введение

За последние три десятилетия вызрела тенденция к использованию аутологичной плазмы обогащённой тромбоцитами (АПОТ/PRP) в гнойной, реконструктивной и пластической хирургии. Сфера применения PRP- терапии расширилась от стимуляции регенерации костей, заживления ран и язв, скелетно-мышечных травм до повышения возможностей в приживлении различных видов трансплантатов. Благодаря природным свойствам плазмы обогащённой тромбоцитами введение её в организм человека является одной из перспективных процедур в восстановлении тканей. После разрушения тромбоцитов АПОТ содержит а-гранулы, из которых после активации высвобождается множество факторов, таких как трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), фактор роста эндотелия сосудов (VGFF) и эпидермальный фактор роста (EGF).

Обзор фокусирует внимание на определении АПОТ, различных методах её подготовки и активации, а также концентрации факторов роста.

Нынешнее состояние проблемы использования АПОТ несёт в себе огромную перспективу по развитию методологии, которая обусловлена многими аспектами, делающими эту процедуру простой:

Назначение обогащённой тромбоцитами плазмы:

Аутологичная плазма обогащённая тромбоцитами наиболее широко применяется для следующих терапевтических эффектов: заживление ран, ангиогенез и ремоделирование тканей. Тем не менее, терапевтические эффекты АПОТ всё ещё противоречивы, отчасти из-за отсутствия оптимизированных и стандартизированных протоколов подготовки.

Исходно методология была разработана с целью разделения эритроцитов и плазмы из цельной крови (ЦК) для различного рода гемотрансфузий. АПОТ впервые была применена для гемостаза во время хирургических операций и переливания тромбоцитов при некоторых тромбоцитопенических состояниях [1]. В 1985 г. Дэвид Кнайтон впервые применил плазму обогащённую тромбоцитами для лечения хронических трофических язв [2]. Как оказалось, АпОТ более безопасна, чем регенеративная терапия на клеточной основе. Ещё с 1998 г. независимо друг от друга несколько американских исследовательских групп начали проводить исследования АПОТ для ускорения заживления ран и восстановления тканей в челюстно-лицевой хирургии. постепенно началось её использование и в других областях, таких как кардиохирургия, офтальмология, ортопедия, пластическая хирургия, спортивная медицина и косметология [3].

В течение последнего десятилетия активно проводились исследования по применению АПОТ в сфере урологических нозологий. Так в условиях эксперимента было изучено влияние АПОТ на восстановление эректильной функции при повреждении кавернозных нервов [4, 5]. М.Е. Чалый и М.В. Епифанова в клинической практике доказали эффективность плазмы обогащённой тромбоцитарными факторами роста в лечении эректильной дисфункции [6].

H.H. Tavukcu et al. в эксперименте на крысах изучили профилактическое воздействие АПОТ на формирование стриктуры уретры при её повреждениях [7]. c.A. Sekerci et al. на модели ишемии/ реперфузии яичка у самцов крыс после деторсии показали, что АПОТ, ингибируя инфильтрацию нейтрофилов и окислительный стресс, усиливает антиоксидантную защиту, оказывая защитное действие на ткани яичка [8]. M.G. culha et al. установили, что лечение с применением АПОТ может быть эффективным при фибробластической индурации полового члена [9].

В 2016 г. учёные из Анкары смоделировали цистит у 36 кроликов и в последующем внутрипузырно вводили АПОТ доказав при этом, что инстилляции увеличивают митотический индекс, уменьшая такое осложнение при циститах, как макрогематурия [10]. Другое подобное исследование опубликовано в декабре 2016 г., где в условиях эксперимента был смоделирован цистит у 18 самок крыс путём введения циклофосфамида и изучен эффект применения плазмы обогащённой тромбоцитами [11]. Fabrizio Muzi et al. впервые использовали АПОТ в комбинации с гипербарической оксигенацией у пациенток с бактериальным и интерстициальным циститом. Было зарегистрировано, что после лечения все пациентки отметили субъективное снижение уровня боли и ургентных симптомов, а спустя 2 месяца при эндоскопическом исследовании не выявлено воспаления и признаков тригонита [12]. положительные результаты лечения интерстициального цистита с применением АПОТ также представлены в работах группы учёных во главе с Jia-Fong Jhang [13, 14]. Исследования, проведённые E.L. Matz et al. с ноября 2012 г. по июль 2017 г., подтвердили безопасность и практическую значимость методики в лечении пациентов с урологическими заболеваниями [15]. Таким образом данные литературы показывают перспективу и целесообразность применения плазмы обогащённой тромбоцитами в урологии.

Методики для получения АПОТ

АПОТ готовят центрифугированием, изменяя относительную центробежную силу, температуру и время центрифугирования. Двухэтапная процедура даёт самый высокий результат [16-19].

В современной литературе существует множество протоколов, описывающих оптимальные условия центрифугирования. Однако различные протоколы были оптимизированы с учётом различных переменных процесса, таких как объём ЦК, количество вращений, период времени центрифугирования и диапазон центробежного ускорения. Учитывая сложность аутологичного продукта, такого как АПОТ, и необходимость контроля качества в клинической практике, крайне важно продемонстрировать способность процедуры воспроизводить последовательные результаты.

Несмотря на реальные различия, все протоколы следуют общей последовательности, которая состоит из сбора крови, первоначального центрифугирования для отделения эритроцитов, последующего центрифугирования для концентрирования тромбоцитов и других компонентов, и активации образца путём добавления агониста тромбоцитов.

Забор цельной крови

Цельная кровь забирается в пробирки с антикоагулянтом. Немаловажная задача — выбор антикоагулянта, способного сохранить наилучшую функциональность и морфологию тромбоцитов.

Что касается типа используемого антикоагулянта, большинство авторов не рекомендуют использовать этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), потому что она вызывает повреждение мембраны тромбоцитов. поэтому рекомендуются антикоагулянты с цитратом и декстрозой цитрата натрия [20].

M.B. Callan at al. (2009) и W.G. Guder at al. (2009) сравнили влияние цитрата натрия и антикоагулянта цитрат декстрозы раствор А (ACD-A) на агрегацию тромбоцитов, pH и концентрацию внеклеточного ионизированого кальция (iCa). Антикоагулянт ACD-A признан выбором для сбора тромбоцитов путём афереза, тогда как тринатрийцитрат (3,2 % или 3,8 %) оказался антикоагулянтом, наиболее часто используемым для диагностической оценки тромбоцитов. Растворы тринатрийцитрата и ACD-A заметно различаются по pH, при этом ACD-A имеет pH 4,9, а 3,6 % цитрат натрия имеет pH 7,8. Кроме того, концентрация иона цитрата в ACD-A составляет 15,6 мг/мл, тогда как 3,8 % цитрата натрия содержат 24,4 мг иона цитрата/мл. Изменения pH и внеклеточный уровень концентрации ионов кальция PRP могут влиять на агрегацию тромбоцитов in vitro. В связи с агрегацией, как правило, нарушающейся в кислой среде, имеет место более низкая концентрация внеклеточных ионов кальция [21, 22].

В качестве альтернативы можно использовать цитрат фосфат-декстроза-аденин. Он похож на ACD-A, но содержит меньше вспомогательных ингредиентов и, следовательно, на 10 % менее эффективен в поддержании жизнеспособности тромбоцитов [23].

Как показал анализ литературы, существует определённый спектр мнений относительно забора крови для приготовления АПОТ.

R. Amable et al. производился забор крови с использованием пробирок для сбора крови объёмом 4,5 мл, содержащих 0,5 мл раствора цитрата [16].

A.G. Perez et al. для приготовления плазмы обогащённой тромбоцитами производили забор цельной крови объёмами до 3,5 мл в пробирки с содержанием 3,2 % цитрата натрия, как антикоагулянта [17].

R A. Kahn et al. для исследования брали 478 мл крови [24].

S.J. Slichter и L.A. Harker использовали образцы из 250 - 450 мл цельной крови [25].

R. Landesberg et al. забор цельной крови производили в объёме 5 мл, содержащие либо 0,5 мл 0,129 моль/л цитрата натрия или 0,048 мл 15 % этилендиаминтетрауксусной кислоты [18].

H. Jo et al. забор выполняли в объёме 40 мл цельной крови, образцы делились на 9 мл, к которым добавляли 1,25 мл цитрат фосфат декстроза аденин-1 (cPDA-1) [19].

O. Bausset et al. обрабатывали 8,5 мл крови [26].

S. Тамiмi et al. использовали 8,5 и 3,5 мл крови, её центрифугировали в цитратных пробирках, содержащих 0,5 мл тринатрийцитрата, цитрата и ACD-A в качестве антикоагулянтов [27].

A.D. Mazzocca et al. использовали кровь в объёме 10 - 27 мл [28].

E. Anitua et al. забор цельной крови производили в стерильные пробирки объёмом 4,5 мл, содержащие 3,8 % (мас./об.) цитрата тринатрия [29].

А. Dugrillon et al. получали PRP из 250 мл аутологичной крови [30].

J. Araki et al. в своём протоколе цельную кровь отбирали венопункцией в объёме 40 - 72 мл, собирали и разделяли на аликвоты по 7,5 мл в конических пробирках по 15 мл и центрифугировали [31].

Изучив опыт различных клиник, мы пришли к заключению, что для оптимального приготовления 15 - 20 мл плазмы обогащённой тромбоцитами, необходимо произвести забор цельной крови в объёме 100 мл из кубитальной вены в шприц объёмом 100 мл, предварительно содержащий 10 000 ЕД гепарина.

Центрифугирование цельной крови

P.R. Amable et al. использовали силу центробежного вращения (RCF) от 240 до 400xg, время от 8 до 19 минут и температуру от 80 до 160C. Все этапы выполняли в центрифуге с охлаждением. Наилучшие характеристики были получены при использовании параметров 300xg в течение 5 минут при 120C и 240xg в течение 8 минут при 160C для первого центрифугирования. Второе центрифугирование было применено при 700xg в течение 17 минут, так как оно позволяло снизить потери тромбоцитов. При втором центрифугировании извлечение 2/3 остаточной плазмы способствовало повышению количества тромбоцитов (70 - 80 %) и пятикратной их концентрации [16].

У A.G. Perez et al. при первом центрифугировании центробежная сила составляла 100xg в течение 10 минут, второе центрифугирование — 400xg в течение 10 минут [17].

R. A. Kahn et al. в процессе исследования обнаружили, что для оптимальных условий выхода тромбоцитов необходимы следующие условия центрифугирования — 3800 об/мин (3731xg) в течение четырёх минут [24].

S. J. Slichter и L.A. Harker центрифугирование проводили при 1000xg в течение 9 минут. Было также отмечено, что последующий этап центрифугирования при 3000xg в течение 20 минут снижал жизнеспособность тромбоцитов [25].

R. Landesberg et al. осуществляли двойное центрифугирование при 200xg в течение 10 минут на одну фазу центрифугирования [18].

C.H. Jo et al. использовали двухэтапное центрифугирование. Цельную кровь центрифугировали от 500xg до 1900xg с увеличением силы центробежного ускорения на 200xg в течение 5 минут и от 100xg до 1300xg с увеличением силы центробежного ускорения 200xg в течение 10 минут. На втором этапе центрифугирования тромбоциты в отделённой плазме центрифугировали при 1000xg в течение 15 минут, 1500xg в течение 15 минут, 2000xg в течение 5 минут и 3000xg в течение 5 минут. Они достигали лучшей эффективности (92 %), применив ускорение 900xg в течение 5 минут для первого центрифугирования. Максимальная эффективность для второго центрифугирования (84 %) была получена при применении 1500xg в течение 15 мин [19].

О. Bausset et al. обнаружили, что центрифугирование 130xg или 250xg в течение 15 минут было оптимальным при выполнении процедуры, включающей два центрифугирования [26].

S. Тамiмi et al. сравнили две методики получения PRP — двойное центрифугирование и одиночное центрифугирование. При двойном центрифугировании три пробирки, каждая объёмом 8,5 мл, помещали в центрифужную машину и подвергали действию 160xg (1300 об/мин) в течение 10 минут. Для второго центрифугирования применяли центробежное усиление 400xg (2000 об/мин) в течение 10 минут. При одиночном центрифугировании пробирки центрифугировали с силой 280xg (1500 об/мин) в течение 7 минут. Концентрация тромбоцитов при двойном центрифугировании составила 336 % и при одиночном — 227 % соответственно [27].

A.D. Mazzocca et al. проанализировали три протокола для приготовления образцов PRP с различным составом: процесс с низким содержанием тромбоцитов (382x103/мм3) и низким количеством лейкоцитов ф^юУмм3) с одним этапом центрифугирования при 1500 об/мин. в течение 5 минут (10 мл ЦК); процесс с высоким содержанием тромбоцитов (940x103/мм3) и высоким содержанием лейкоцитов (17x103/мм3) с одной стадией центрифугирования при 3200 об/ мин в течение 15 минут (27 мл ЦК); и процесс двойного вращения (1500 об/мин в течение 5 минут и 6300 об/мин в течение 20 минут), который давал более высокую концентрацию тромбоцитов (472 x 103 / мм3) и более низкую концентрацию лейкоцитов 1,5×103/мм3) [28].

E. Anitua et al. использовали одноэтапное центрифугирование при 460xg в течение 8 минут, и этот протокол получил коэффициент концентрации тромбоцитов в 2,67 раза выше базового значения [29].

А. Dugrillon et al. доказали, что концентрация TGF-β1 и тромбоцитов пропорционально связана с силами центрифугирования, когда силы меньше 800xg. Концентрация TGF-β1 обратно пропорционально связана с центробежной силой, когда её показатели превышают 800xg [30].

J. Araki et al. центрифугировали пробирки при 200 С в центрифуге с охлаждением (Kubota 5900; Kubota Со.). Оптимизировали протокол для приготовления PRP путём центрифугирования ЦК при 230 - 270xg в течение 10 минут. Для второго этапа применяли ускорение 2300xg в течение 10 минут [31]. Следует отметить, что температура во время обработки имеет решающее значение для предотвращения активации тромбоцитов. В руководстве Американской ассоциации банков крови (AABB) рекомендуют 21 - 240 С для центрифугирования крови при получении PRP [32].

M. Macey et al. [33] также заявили, что охлаждение может замедлить активацию тромбоцитов, и это может быть важно при получении PRP с жизнеспособными тромбоцитами. Многие авторы использовали уровень температуры 12 - 160 С во время центрифугирования для лучшего извлечения тромбоцитов. Это актуально для тех, кто использует центрифугу для приготовления PRP, которая, в основном, предназначена для диагностических целей, а не для специализированного приготовления плазмы обогащённой тромбоцитами и, следовательно, не может обеспечить достаточную концентрацию тромбоцитов [34].

Y. Kececi et al. для первого центрифугирования выбрали силу равную 250 - 270xg в течение 10 минут. При втором этапе центрифугирующая сила варьировала от 300xg, 500xg, 750xg, 1000xg, 1500xg и 2000xg в течение 10 минут. Коэффициент концентрации тромбоцитов увеличивался по мере того, как центробежная сила второго вращения увеличивалась в 1,92, 2,16, 2,80, 3,48, 3,67 и 3,76 раза после 10-минутного второго центрифугирования при 300xg. 500xg, 750xg, 1000xg, 1500xg и 2000xg соответственно. Авторы высказали мнение, что получение определенной концентрации тромбоцитов возможно путём индивидуальной регулировки силы центрифугирования в соответствии с личным исходным значением [35].

R.C. Tsay et al. использовали методику приготовления при помощи одноэтапного центрифугирования при оборотах 3200 в минуту [36].

N. Kakudo et al. плазму обогащенную тромбоцитами готовили с использованием метода двойного центрифугирования с подсчётом количества тромбоцитов на каждой стадии приготовления [37].

На базе НИИ-ККБ №1 г. Краснодара приготовление плазмы обогащённой тромбоцитами производится следующим образом: забор аутокрови выполняют в шприц объёмом 100 мл, содержащий 10 000 Ед гепарина. Далее она разливается в стерильные пробирки по 50 мл. После чего проводится центрифугирование в течение 15 минут на скорости 2000 оборотов в минуту, на первом этапе центрифугирования плазма и тромбоциты отделяются от эритроцитов и лейкоцитов. Далее плазму с тромбоцитами отбирают шприцом. переливают в чистую пробирку, и центрифугируют 10 минут на скорости 3500 оборотов в минуту. Всего получается около 15 - 22 мл плазмы обогащённой тромбоцитами, с концентрацией тромбоцитов до 600 % от их нормального показателя в крови. Производится отбор верхнего слоя 20 мл плазмы в новую пробирку, пипеткой тщательно ресуспендируют осадок. Из гомогенной взвеси отбирают 1 мл на анализ крови для определения количества тромбоцитов. пробирку с плазмой обогащённой тромбоцитами помещают в морозильную камеру -400 С и в дальнейшем передают в операционную.

Активация тромбоцитов

Активация — это процесс дегрануляции, который приводит к слиянию а-гранул с мембраной тромбоцитов, причём секреторные белки становятся биологически активными в результате добавления гистонов и боковых цепей углеводов [23, 38].

R.E. Marx et al. описали активацию путём смешивания 6 мл PRP, 1 мл хлористого кальция и тромбина (10 мл 10 % кальция хлорида смешивали с 10 тысячами единиц бычьего тромбина) [39]. Однако активация PRP тромбином обычно приводит к выбросу факторов роста, высвобождающихся в течение 10 минут после свёртывания, и более 95 % высвобождается через 1 час [23, 38]. Добавление только CaCl2 без тромбина является альтернативным способом активации PRP. Добавление CaCl2 приводит к образованию аутологичного тромбина из протромбина и возможному образованию рыхлой фибриновой матрицы, которая будет захватывать факторы роста, что приводит к медленной секреции факторов роста в течение 7 дней. Этот метод наиболее часто используется при клиническом применении PRP.

G. Wiebrich et al. использовали иной метод активации — цикл замораживания / размораживания. Количество тромбоцитов в плазме обогащённой тромбоцитами в 5 раз превышало концентрацию, чем в донорской крови. Был проведён анализ активации: содержание факторов роста плохо коррелировало с количеством тромбоцитов в цельной крови, и с обогащённой тромбоцитами плазмой (р = 0,35). Никаких влияний пола или возраста на количество тромбоцитов или концентраций факторов роста обнаружено не было [40].

R.C. Tsay et al. активировали PRP при помощи бычьего тромбина или при помощи пептида-активатора рецептора тромбина-6 (TRAP). Кроме того, PRP была активизирована с использованием Allogro (Ceramed, Lakewood, CO), BioGlass (Mo- Sci, Rolla, MN) или BioOss (Osteohealth, Shirley, NY). При активации PRP тромбином происходит значительное немедленное высвобождение факторов роста. TRAP-BS может оказаться более эффективным, чем тромбин, в поддержании уровней факторов роста [36].

N. Kakudo et al. проводили активацию PRP аутологичным тромбином и хлористым кальцием. PRP содержала примерно в 7,9 раз больше тромбоцитов, чем цельная кровь, и её активация была связана с высвобождением большого количества PDGF-AB и TGF-бета! [37].

Q. Huang et al. получали ЦК из банка крови, а метод активации — тромбин + CaCl2 [41].

G. Pietramaggiori et al. изучили влияние плазмы обогащённой тромбоцитами на вялотекущие трудно заживающие раны. Кровь брали из «банка крови», а разрушение тромбоцитов проводили ультразвуком [42].

На сегодняшний день оптимальный способ активации тромбоцитов — это добавление 10 % раствора хлорида кальция. Следует отметить, что при данной методике более 95 % факторов роста будет высвобождаться в течение одного часа. Добавление хлористого кальция приводит к образованию аутологичного тромбина из протромбина в АПОТ и возможному образованию свободной фибриновой матрицы, которая будет захватывать факторы роста, что приводит к медленной секреции факторов роста в течение 7 дней. Именно этот метод активации применяется в нашей клинике [43-45].

В нашем исследовании средняя концентрация тромбоцитов в исходной крови составила 305 тысяч (в норме от 170 до 432 тысяч тромбоцитов), после центрифугирования 982 тысячи (от 502 тысяч до 1667 тысяч тромбоцитов), после размораживания концентрация тромбоцитов составила 509 тысяч.

Механизм действия АПОТ

Тромбоциты участвуют в регенерации тканей за счёт факторов роста и других активных молекул (хемокинов, арахидоновой кислоты, фибриногена и фибрина). В настоящее время изучено более 30 факторов роста, содержащихся в а-гранулах. После активации тромбоцитов тромбином или кальция хлоридом, происходит высвобождение а-гранул. Известно, что а-гранулы тромбоцитов содержат митогенные и хемотаксические факторы роста, такие как тромбоцитарные факторы роста (PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB), два трансформирующих фактора роста (TGF-β1 и TGF-β2), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эпителия (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1 и IGF-2) [22]. Влияние этих факторов роста на поведение клеток и последовательность регенерации тканей были тщательно изучены [34, 45].

Было доказано, что за счёт широкого спектра факторов роста АПОТ стимулирует образование коллагена, ускоряет регенерацию тканей, индуцирует рост сосудов, эндотелия, обеспечивает гемостаз, уменьшает боль, обладает противовоспалительным эффектом, снижает риск инфекционных осложнений, предотвращает послеоперационные осложнения [7]. В основе этих эффектов лежит синергичное взаимодействие с местными клетками, обусловливающее специфические реакции пролиферации, клеточной миграции и синтез экстрацеллюлярного матрикса [46].

Поскольку факторы роста стимулируют клеточную пролиферацию, высказывается опасение, что АПОТ может стимулировать рак. На самом деле, никакой фактор роста не может спровоцировать рак. Все факторы роста действуют на клеточные мембраны, а не на клеточное ядро. Факторы роста активируют внутренний цитоплазматический сигнальный белок, который способствует нормальной экспрессии генов, а не аномальной экспрессии генов. Факторы роста не являются мутагенами в отличие от доказанных канцерогенов, таких как радиация, табачные антраценовые смолы, ультрафиолетовое излучение и т.д. Факторы роста являются нормальными белками организма. Безопасность, связанная с АПОТ и раком, заключается в том, что АПОТ — это не что иное, как тот же сгусток крови, который был бы в любой нормальной ране, за исключением того, что он содержит большее количество тромбоцитов. И самое главное, введение аутологичной плазмы обогащённой тромбоцитами не относится к терапии стволовыми клетками [47].

Заключение

АПОТ является источником огромного количества активных веществ (факторов роста) и обладает мощным репаративным потенциалом. Однако реализация этого потенциала варьирует в широких пределах в зависимости от способа приготовления и цели использования плазмы обогащённой тромбоцитами. Существует множество протоколов для подготовки АПОТ, каждый из которых имеет свои стандартизированные параметры и заявленные результаты. Клиницисту требуется чётко определить цель для реализации оригинальных задач, с последующей стандартизацией методики для получения оптимального клинического ответа.