Согласно статистическим данным, бесплодием страдает примерно 15% пар. При этом 40 – 50% всех случаев приходится на мужское бесплодие [1 – 4]. В соответствии с литературными данными мужское бесплодие может быть вызвано такими распространёнными причинами, как инфекции, передаваемые половым путём (22,1%), варикоцеле (14,9%), эндокринные нарушения (14,8%), обструкция семявыносящих путей (2%), генетические аномалии (2,8%), аутоиммунные процессы (4,7%). Есть и другие факторы, которые косвенно влияют на репродуктивную систему, например, метаболический синдром и оксидативный стресс [1][2][5 – 7]. При этом, согласно актуальным данным, доля случаев мужского бесплодия, причины которого не удалось установить, составляет от 25% до 40% [4].

Основой механизма действия разрабатываемого лекарственного средства является стимуляция выработки соматостатин-специфических антител и ингибирование действия соматостатина, что впоследствии приводит к увеличению содержания в организме соматотропина [8] и опосредованному увеличению уровня инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), что в результате может приводить к повышению качественных характеристик спермы.

С учётом основополагающей роли фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов в регуляции синтеза IGF-1 в семенниках стоит отметить, что косвенную роль в регуляции содержания IGF-1 в семенниках может играть соматотропин, потенцируя действие гонадотропинов. Исследования роли IGF-1 при идиопатическом бесплодии продолжаются и в настоящее время. Отмечается, что у 10% мужчин, страдающих бесплодием неясного генеза, наблюдается положительный эффект на фоне терапии гормоном роста [5].

В соответствии с ранее проведёнными исследованиями было выявлено значительное снижение IGF-1 у пациентов с идио­патическим мужским бесплодием. Была установлена зависимость уровня IGF-1 от стадии сперматогенеза. Экспрессия IGF-1 снижается от сперматогоний к сперматозоидам. Инсулиноподобный фактор роста 1 играет крайне важную роль в процессе сперматогенеза, селекции мужских половых клеток и элементов микроокружения семенных канальцев. Спектр действия IGF-1 и его рецепторов на мужские половые клетки, в первую очередь, заключается в стимуляции пролиферации, стероидогенеза и этапов половой дифференцировки сперматогоний в первичные сперматоциты. Концентрация IGF-1 прямо коррелирует с количеством сперматоцитов, находящихся на стадии пахитены [9 – 12]. Таким образом, снижение уровня IGF-1 может являться одним из факторов, имеющих место при идиопатическом мужском бесплодии. Гормональная терапия для улучшения мужской фертильности с использованием нескольких гормонов гонадотропной оси показала переменные результаты с небольшим улучшением клинического состояния. По существующей теории, через стимуляцию продукции IGF-1 гормон роста может воздействовать на сперматогенез [13][14].

Цель исследования: оценить фармакологическую активность препарата на основе соматостатинсодержащего белка на самцах крыс с лейпрорелин-индуцированным нарушением сперматогенеза.

Проведённое исследование входило в комплекс доклинических исследований по оценке безопасности и эффективности нового лекарственного препарата на основе рекомбинантного соматостатинсодержащего белка.

Тестируемым препаратом являлось новое лекарственное средство на основе соматостатинсодержащего белка (ООО «ЮРСФАРМ», Россия). Действующее вещество представляет собой рекомбинантный белок, содержащий соматостатин (СОМ), состоящий из белка носителя — глюкан-связывающего домена (ГСД), спейсерной последовательности (-) и двух копий антигенной детерминанты соматостатина (ГСД-СОМ-СОМ) с молекулярной массой 39 кДа [8].

Эксперимент проводили на самцах крыс линии Wistar в возрасте 3 – 4 недель и массой тела 71 – 97 г, полученных из питомника АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» (Россия). Условия содержания животных соответствовали Директиве 2010/63/EU от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Для питания использовали «Корм для содержания лабораторных животных» ПК-120-1, приготовленный по ГОСТу 34566-2019.

Индукцию патологии проводили путём однократного подкожного введения лейпрорелина (Люкрин депо®, Takeda Pharmaceutical Company, Ltd, Osaka, Japan) в дозе 600 мкг/кг [15]. Применение лейпрорелина нарушает сперматогенез путём десенситизации рецепторов на поверхности клеток гипофиза, реагирующих на гонадтропин-рилизинг-гормон, что приводит к уменьшению секреции гонадотропинов и половых гормонов. В соответствии с инструкцией по медицинскому применению у мужчин при длительном применении лейпрорелина концентрация тестостерона снижается до кастрационного и препубертатного уровней1.

Животные были распределены на 5 групп по 10 самцов крыс в каждой группе: группа 1 — интактная; группа 2 — негативный контроль (патология + контрольное вещество); группа 3 — патология + тестируемый препарат в дозе 10 мкг/кг; группа 4 — патология + тестируемый препарат в дозе 50 мкг/кг; группа 5 — патология + тестируемый препарат в дозе 250 мкг/кг. В качестве контрольного вещества использовали раствор натрия хлорида 0,9%. Тестируемый препарат и контрольное вещество вводили животным подкожно двукратно с интервалом 2 недели (в 1‑й и 14‑й дни эксперимента), как представлено на рисунке. Подобная схема введения широко используется для достижения необходимого иммунологического ответа2. Выбор сроков введения тестируемого препарата и индуктора патологии был сделан на основании ожидаемых параметров кинетики выработки антител и периода формирования патологии. Животных эвтаназировали на 35‑й день эксперимента с помощью диоксида углерода (CO2) с последующим обескровливанием из полостей сердца.

В течение эксперимента проводили ежедневное наблюдение за общим состоянием животных, еженедельно регистрировали изменения массы тела. Для оценки уровня тестостерона у животных всех экспериментальных групп отбирали образцы крови из хвостовой вены, а также из полостей сердца во время проведения плановой эвтаназии. Образцы крови, собранные в день эвтаназии, также использовали для определения уровня соматотропина. Для оценки спермограммы прижизненно забирали образцы биологического материала методом трансректальной электростимуляции семенных бугорков [16]. В день эвтаназии образцы спермы забирали из придатков семенников.

Концентрации соматотропина и тестостерона определяли с использованием коммерчески доступных наборов: “Elisa kit for Growth Hormone (GH)” (“Cloud-Clone Corp.”, Katy, TX, USA) и «Тестостерон-ИФА-бест» («Вектор-Бест», Санкт-Петербург, Россия) при двух длинах волн 450 нм и 650 нм на многофункциональном микропланшетном анализаторе “CLARIOstar” (“BMG Labtech” GmbH, Ortenberg, Germany).

Во время эвтаназии у животных извлекали и взвешивали семенники, придатки семенников и семенные пузырьки. Далее образцы фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина для дальнейшего гистологического анализа [17]. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ гистологических срезов проводили при помощи светооптического микроскопа Accu-Scope 3000 SERIES (“Accu Scope Inc.”, Commak, NY, USA) при увеличении 40, 100 и 400. Оценка семенников осуществлялась по следующим критериям:

0 — нет изменений;

1 — минимальные изменения;

2 — умеренно выраженная дистрофия, появление в просвете канальцев отдельных изменённых сперматоцитов, умеренное нарушение стратификации слоев;

3 — максимально выраженная дистрофия сперматоцитов, множество изменённых клеток в просвете, стратификация слоев значительно нарушена.

Этическое заявление. Исследование одобрено локальной независимой биоэтической комиссией АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ» (№БЭК 3.29/19 от 15 мая 2019 года). Исследование соответствовало принципам «трёх R» (Reduction, Refinement, Replacement).

Статистический анализ. Для анализа данных и построения графиков использовали лицензированное программное обеспечение Statistica v.10.0 (“StatSoft Inc.”, Tulsa, OK, USA) и Prism 9.0 (“GraphPad Software Inc.”, Graphpad Holdings LLC, San Diego, CA, USA). Все данные были проверены на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Shapiro-Wilk. В зависимости от типа распределения данные были представлены в виде среднего значения (M), стандартного отклонения (SD), медианы (Me) и квартильного размаха [ Q1; Q3]. Далее применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) или критерий Kruskal-Wallis. В качестве апостериорного анализа использовали критерий Tukey с поправкой Welch на неодинаковые размеры групп или тест Dana. Различия были определены при 0,05 уровне значимости.

На протяжении всего эксперимента отклонений в поведении и общем состоянии животных не наблюдали, отмечали равномерный прирост массы тела экспериментальных животных во всех группах.

По результатам анализа спермограммы в интактной группе животных концентрация сперматозоидов в среднем составляла 71,8 × 10⁶/мл на протяжении эксперимента. На долю подвижных сперматозоидов приходилось 73,6% от общего количества сперматозоидов. Доля живых сперматозоидов составляла 72,6%, мертвых — 21,2% и незрелых — 6,3%. В группе негативного контроля с 21-го дня эксперимента (через 7 дней после индукции патологии) наблюдалось статистически значимое уменьшение концентрации сперматозоидов, доли подвижных и живых сперматозоидов наряду с увеличением доли неподвижных и незрелых форм в сравнении с интактной группой (р < 0,05). Данные изменения в группе негативного контроля сохранялись до окончания эксперимента, что подтвердило развитие модельной патологии.

На фоне введения тестируемого препарата наблюдали дозозависимое увеличение концентрации сперматозоидов, достигшее статистической значимости при дозе 250 мкг/кг (увеличение в среднем на 20,4%) в сравнении с группой негативного контроля (р < 0,05). К 28-му и 35-му дням эксперимента (через 14 и 21 день после введения лейпрорелина) концентрация сперматозоидов у животных, получавших тестируемый препарат в дозе 250 мг/кг, соответствовала значениям животных интактной группы. В дозах 50 и 250 мкг/кг регистрировали значимое увеличение доли подвижных сперматозоидов и их живых форм наряду с уменьшением доли неподвижных сперматозоидов и незрелых форм спустя 7 – 14 дней после введения лейпрорелина (в сравнении с группой негативного контроля) (табл. 1).

Кроме вышеперечисленных изменений, в группах животных с лейпрорелин-индуцированным нарушением сперматогенеза наблюдали сперматозоиды с аномалиями строения в виде отсутствия хвоста, хаотичные колебательные движения головки с шейкой вокруг своей оси. Данные изменения регистрировали во всех экспериментальных группах с индуцированной патологией, но наиболее часто патологические формы сперматозоидов встречались в группе негативного контроля и у животных, получавших тестируемый препарат в дозе 10 мкг/кг. У животных, получавших тестируемый препарат в дозах 50 и 250 мкг/кг, патологические формы сперматозоидов наблюдали в единичных случаях.

У животных интактной группы значения концентрации тестостерона с 21-го (через 7 дней после введения индуктора) по 35‑й дни эксперимента находились в пределах 1,37 – 21,18 нмоль/л, что согласуется с литературными данными [19]. В группе негативного контроля у животных с лейпрорелин-индуцированным нарушением сперматогенеза диапазон значений тестостерона был существенно ниже, составляя 0,46 – 8,34 нмоль/л. Наиболее выраженное негативное воздействие на уровень концентрации тестостерона наблюдали на 28‑й день эксперимента (через 14 дней после введения лейпрорелина). В этот период снижение концентрации тестостерона у животных контрольной группы относительно интактной группы составило 70% (критерий Тukey, p < 0,05).

У животных, получавших тестируемый препарат в дозах 50 и 250 мкг/кг, в образцах плазмы крови на 28‑й день эксперимента отмечали дозозависимое повышение тестостерона в сравнении с группой негативного контроля на 65 и 75% соответственно (табл. 2).

У животных интактной группы уровень соматотропина в плазме крови на 35‑й день эксперимента находился в диапазоне 0,45 – 1,70 нг/мл. У самцов крыс с лейпрорелин-индуцированным нарушением сперматогенеза без лечения (группа негативного контроля) уровень соматотропина был ниже значений интактной группы в среднем на 45% (табл. 2).

Влияние тестируемого препарата на уровень соматотропного гормона (СТГ) у животных с патологией было зарегистрировано только в дозе 250 мкг/кг, отмечено статистически значимое увеличение на 67% уровня соматотропина в сравнении с группой негативного контроля и превышение значений в интактной группе в 1,5 раза.

Однократное введение индуктора патологии оказало выраженное влияние на органы репродуктивной системы. Так, наблюдали значимое уменьшение массы и массовых коэффициентов эпидидимисов у животных группы негативного контроля в сравнении с интактной группой (p < 0,05) (табл. 3). В группах, получавших тестируемый препарат в исследуемых дозах, отмечалось дозозависимое увеличение массы исследуемых органов в сравнении с группой негативного контроля, но не достигавшее статистической значимости.

В интактной группе дистрофические изменения семенников отсутствовали. У животных с модельной патологией чаще всего встречались минимальные дистрофические изменения сперматогенного эпителия, реже — умеренно выраженная дистрофия с отдельными изменёнными сперматоцитами, максимально выраженная дистрофия сперматоцитов со множеством изменённых клеток в просвете и значительным нарушением стратификации слоёв отмечена в единичных случаях. В таблице 4 представлены данные о состоянии дистрофических изменений в семенных канальцах у самцов аутбредных крыс. Отмечено статистически значимое увеличение частоты дистрофических изменений у животных группы негативного контроля на 25% и групп, получавших тестируемый препарат в дозах 10 и 50 мкг/кг, на 25% и 15% соответственно в сравнении с животными интактной группы. В группе, получавшей тестируемый препарат в дозе 250 мкг/кг, дистрофические изменения встречались в 10% случаев без статистически значимых отличий по частоте от интактной группы. Наблюдали дозозависимую тенденцию к снижению развития дистрофических изменений в группах животных, получавших тестируемый препарат в исследуемом диапазоне доз (табл. 4).

При гистологической оценке сперматогенеза по критериям, предложенным S.G. Johnsen [18], у большинства животных во всех группах наблюдали нормальный сперматогенез с сохраненной рядностью эпителия (оценивали как 10 баллов). Слегка нарушенный сперматогенез со слабой дез­организацией эпителия и наличием большого числа поздних сперматид (9 баллов) был выявлен у большинства животных. Реже наблюдали уменьшение количества сперматозоидов и поздних сперматид (8 баллов). Поскольку данная картина была зарегистрирована во всех экспериментальных группах, включая интактную, обнаруженные изменения следует считать проявлением, зависящим, возможно, от гормонального фона животных и функционального состояния отдельных извитых канальцев.

Выявленные патологические изменения не носили тотальный характер и распределялись в семенниках одного и того же животного неравномерно: канальцы с нормальным и нарушенным сперматогенезом (7 и 6 баллов) наблюдали рядом.

В исследовании была проведена оценка эффективности нового лекарственного средства, предназначенного для индукции выработки специфических антител к соматостатину (анти-СОМ-IgG) и опосредованной стимуляции СТГ на модели нарушения сперматогенеза у самцов крыс, вызванного введением лейпрорелина. Соматотропный гормон оказывает влияние на репродуктивную физиологию мужчин, такое как стимулирование стероидогенеза, повышение чувствительности к гонадотропинам, а также значительное стимулирующее действие на сперматогенез.

Результаты проведённого исследования согласуются с литературными данными. В группе негативного контроля у животных с лейпрорелин-индуцированным нарушением сперматогенеза без последующего лечения в эксперименте обнаруживались патологические изменения в тканях семенников. Наблюдали выраженные дистрофические изменения в семенных канальцах, нарушение процесса сперматогенеза в сравнении с интактной группой. При анализе спермограммы значимо снижалась концентрация сперматозоидов и увеличивалась доля неподвижных сперматозоидов наряду со снижением доли подвижных, увеличивалась доля незрелых форм в сравнении с интактной. Также были выявлены патологические формы сперматозоидов без хвостов, наиболее часто встречающиеся именно в данной группе и отсутствующие в интактной. Отмечено значимое снижение концентрации тестостерона в сравнении с интактной группой через 14 дней после индукции патологии, что соответствует литературным данным.

На фоне лечения тестируемым препаратом в исследуемых дозах при гистологическом исследовании тканей семенников наблюдались относительно негативного контроля: положительная дозозависимая тенденция к нормализации процесса сперматогенеза, увеличение массы исследуемых анатомических структур и снижение дистрофических процессов в тканях семенных канальцев. Тестируемый препарат способствовал увеличению доли подвижных сперматозоидов наряду со снижением неподвижных, увеличению доли живых сперматозоидов со снижением доли незрелых, а также увеличению концентрации сперматозоидов. Полученные результаты схожи с литературными данными, показывающими, что введение СТГ приводит к увеличению концентрации и улучшению морфологии сперматозоидов.

Полученные результаты схожи с данными ранее проведённых работ об улучшении показателей сперматогенеза при введении животным экзогенного СТГ, что позволяет предположить возможный механизм действия тестируемого препарата, а именно синтез специфических аутоантител к соматостатину и блокирование его действия, что, в свою очередь, приводит к увеличению содержания в организме эндогенного соматотропного и половых гормонов.

1. Инструкция по медицинскому применению лекарственного препарата Люкрин Депо®. П N015554/01. Ссылка активна на 03.04.2025. URL: https://grls.rosminzdrav.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=5b6b335e-5823-484d-9519-891c96e3b3a0&t=2. Эффективность вакцины в контролируемых и реальных условиях и уровень защиты. ВОЗ. 2021. Дата обновления 10.03.2025. Ссылка активна на 03.04.2025 URL: https://www.who.int/ru/news-room/feature-stories/detail/vaccine-efficacy-effectiveness-and-protection