Известно много заболеваний, сопровождающихся стойкими симптомами со стороны нижних мочевых путей, такими как учащенное мочеиспускание, императивные позывы к нему, болевые ощущения и / или давление в области малого таза, мочевого пузыря.

Одним из таких заболеваний является хронический рецидивирующий цистит, который очень тяжело поддается лечению, особенно при отсутствии осложняющих факторов, которые можно было бы устранить и прервать цикличный процесс рецидивирования воспалительного процесса. Основным терапевтическим мероприятием является назначение антибактериального лечения в соответствии с бактериологическим исследованием мочи. Но что делать, если оно не выявило возбудителя или возбудитель устойчив к исследуемым антибактериальным препаратам? Типичной является ситуация, когда анализы мочи на фоне проведённого лечения в норме, а симптоматика сохраняется.

В мировой литературе в последние годы активно изучается вопрос о ключевой роли воспаления в патогенезе гиперактивного мочевого пузыря, в частности гиперактивный мочевой пузырь рассматривается как начальное проявление симптомов интерстициального цистита. При этом стандартные анализы мочи, как правило, без отклонений от референсных значений [1 – 3].

Нельзя исключить воспаление как причину развития симптомов нижних мочевых путей у мужчин с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и симптомами нижних мочевых путей [4].

В настоящее время основным лабораторным критерием для диагностики воспалительного процесса в почках и мочевыводящих путях является уровень лейкоцитов (главным образом нейтрофилов) в моче. Нейтрофилы в моче свидетельствуют об остром воспалительном процессе, хотя в случае хронического воспаления в стенке мочевого пузыря обнаруживаются скопления лимфоцитов и моноцитов. Кроме того, лейкоцитурия — стандартный диагностический критерий воспаления мочевого пузыря, в том случае если оно локализуется и в уротелии. Известно, что воспалительный процесс часто ограничивается поверхностными слоями стенки мочевого пузыря, особенно субуротелием, но, если воспаление локализуется только в слоях, лежащих глубже уротелия, лейкоцитов в моче может и не быть. Исследования последних лет показывают, что воспаление мочевого пузыря, вызванное проникновением иммунных клеток, может дополнительно усиливаться и поддерживаться резидентными клетками, присутствующими как в уротелии, так и в детрузоре, за счёт высвобождения хемокинов.

В таком случае чрезвычайно важным и актуальным является поиск маркеров, содержание которых специфично повышалось бы в моче в ответ на наличие воспаления в стенке мочевого пузыря. Поиск активно ведётся среди достаточно широкого спектра потенциальных биомаркёров, но идеальный не найден [5][6].

Известно, что инфекционное воспаление является одним из основных ресурсов секреции кальпротектина, S100A8/S100A9 (CLP). После инфицирования бактериями нейтрофилы, макрофаги и моноциты интенсивно экспрессируют и секретируют S100A8/A9 для модуляции воспалительных процессов с индукцией воспалительных цитокинов, активных форм кислорода и оксида азота. S100A8 и S100A9 также обладают антибактериальным потенциалом благодаря своей способности связывать Zn 2+.

Экспрессия и секреция S100A8/9 во время воспаления, вызванного инфекцией, ограничены механизмом регуляции отрицательной обратной связи. Избыточная экспрессия S100A8/A9 усиливает воспалительную реакцию и ускоряет выделение нейтрофилами и макрофагами большего количества цитокинов, что вызывает порочный круг и усугубляет течение заболевания, вызывая хронизацию процесса [7].

Кальпротектин обнаруживается в различных жидкостях организма пропорционально тяжести существующего воспаления. Благодаря высвобождению в очагах воспаления кальпротектин считается индикатором и часто используется в качестве биомаркера для мониторинга воспалительных процессов. Например, фекальный кальпротектин в настоящее время является золотым стандартом для диагностики и мониторинга воспалительных заболеваний кишечника, таких как болезнь Крона и язвенный колит [8]. Более того, сывороточный кальпротектин валидизирован в качестве биомаркера для мониторинга различных (хронических) воспалительных заболеваний, например, ревматоидного артрита [9][10].

Высвобождение кальпротектина может вызывать секрецию множества цитокинов в воспалительных клетках для поддержания и обострения воспаления. S100A8/A9 стимулирует выработку фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и ИЛ-6 [7].

ИЛ-6 является провоспалительным цитокином, участвующим в острофазовом ответе на широкий спектр физиологических нарушений, его мониторинг является очень чувствительным диагностическим тестом острого воспаления.

ФНО-альфа — это цитокин, который оказывает плейотропное действие на различные типы клеток, в основном вырабатываемый активированными макрофагами, Т-лимфоцитами и естественными клетками-киллерами. Известно, что он функционально запускает ряд различных воспалительных молекул, включая другие цитокины и хемокины. Он был идентифицирован как основной регулятор воспалительных реакций и, как известно, участвует в патогенезе некоторых воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Физиологически ФНО-альфа является важнейшим компонентом для нормального иммунного ответа. ФНО-альфа может активировать иммунную систему для регуляции; однако ненадлежащее или избыточное производство ФНО-альфа может быть вредным и привести к заболеванию. Ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориатический артрит, псориаз и неинфекционный увеит вызваны аномальной секрецией ФНО-альфа; таким образом, ФНО-альфа можно классифицировать как ключевой фактор патологического развития [11].

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) стимулирует пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных клеток, увеличивает проницаемость сосудов, опосредует эндотелий-зависимую вазодилатацию и поддерживает выживание сосудов, предотвращая апоптоз эндотелия. Кроме того, VEGF стимулирует хемотаксис моноцитов и экспрессию молекул адгезии. Гипоксия является основным стимулом для экспрессии и / или производства VEGF. Несколько факторов роста и цитокинов, таких как эпидермальный фактор роста, трансформирующий фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста I, ангиотензин II, интерлейкин-1 и IL-6, также обладают потенциалом для повышения экспрессии VEGF [12].

Каждый из перечисленных цитокинов может играть важную роль в патогенезе хронизации воспаления в стенке мочевого пузыря и, возможно, является его потенциальным маркёром.

Цель исследования: изучить цитокиновый статус крови и мочи у женщин с хроническим рецидивирующим циститом.

В исследование проспективно были включены 33 пациентки с диагнозом «Хронический (рецидивирующий) неосложненный цистит», отвечающие критериям включения:

Пациентка не была включена в исследование, если к ней можно было применить следующее: наличие выделений из влагалища, мочекаменной болезни, перенесённого или текущего лучевого цистита, наличие анатомических или функциональных причин расстройств мочеиспускания, в том числе нейрогенных (рассеянный склероз, инсульт и др.), сахарного диабета, острой или хронической почечной недостаточности; клинически выраженных кардиоваскулярных или цереброваскулярных заболеваний в течение 6 месяцев до скрининга, таких как инфаркт миокарда, неконтролируемая стенокардия, выраженная желудочковая аритмия, инсульт и тяжёлая сердечная недостаточность (класс NYHA ≥ III); текущее или перенесённое злокачественное заболевание органов таза, туберкулёз; алкогольная и (или) наркотическая зависимость, текущая или в анамнезе, а также беременность и кормление грудью.

Допускалось применение гормональных препаратов, в том числе местной гормональной заместительной терапии, профилактическое лечение обострений хронического цистита препаратами клюквы, инстилляциями с вязкоэластичными протекторами слизистой мочевого пузыря в течение как минимум 1 месяца на день сбора образцов крови и мочи для анализа на цитокины.

Cкрининг включал сбор жалоб, анамнеза, физикальный осмотр, клинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, ультразвуковое исследование (УЗИ) мочевого пузыря и почек, тест мочи на беременность. Одновременно с забором на указанные анализы были собраны образцы крови и мочи для определения в них уровней цитокинов. В случае удовлетворения критериям включения / невключения проводили исследование ранее полученных образцов для определения уровня кальпротектина, ИЛ-6, фактора некроза опухоли и VEGF.

Всем пациенткам исследуемой группы выполняли цистоскопию с биопсией стенки мочевого пузыря. Биопсийный материал забирали с использованием способа «холодных» щипцов из наиболее патологически измененных областей, в обязательном порядке из области мочепузырного треугольника и боковой и / или задней стенок мочевого пузыря.

При наличии эпизода обострения цистита, подтверждённого лейкоцитурией по данным ОАМ, проводили лечение в соответствии с клиническими рекомендациями. В таком случае цистоскопическое исследование выполняли после купирования острого воспалительного процесса.

В качестве контрольной группы были включены 27 практически здоровых женщин репродуктивного возраста, обследование которых также включало сбор жалоб, анамнеза, физикальный осмотр, анализ крови на креатинин, общий анализ мочи, тест мочи на беременность. Также были собраны кровь и моча для последующего определения уровней цитокинов.

Добровольное информированное согласие на участие в данном исследовании было получено от каждой женщины, принявшей участие.

Исследование цитокинов мочи и крови. Для исследования цитокинов собирали среднюю порцию мочи в стерильную ёмкость. Образцы центрифугировали на скорости около 1000 – 2000 g в течение 10 – 15 минут при температуре 4 °C перед аликвотированием. Супернатанты разделяли на аликвоты в полипропиленовых пробирках объёмом 1,5 мл (1 мл/пробирка) и хранили при температуре ≤ -20 °C.

Образцы крови были получены путём стандартной процедуры венепункции в пробирки с активатором образования сгустка. Через 30 – 60 минут нахождения при комнатной температуре пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут при комнатной температуре.

Аликвоты отбирали из середины объёма полученной сыворотки крови в чистые полипропиленовые пробирки объёмом 0,5 мл, их немедленно помещали в морозильную камеру для хранения при температуре ниже 20 °C.

Для определения кальпротектина использован набор MRP8/14 S100A8/A9 Calprotectin / Кальпротектин [Набор для количественного определения кальпротектина в образцах биологических жидкостей человека иммуноферментным методом] («BÜHLMANN Laboratories AG», Schönenbuch, Switzerland). Интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) определяли с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа концентрации цитокинов (АО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия). Количественное определение уровня биомаркеров в образцах проводилось иммуноферментным методом ELISA в соответствии с инструкциями производителей.

Статистический анализ. Для статистической обработки данных использовали пакет программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). Нормальность распределения проверяли с помощью теста Колмогорова-Смирнова-Lilliefors. Описание показателей представлены в виде средних значений с отклонением на величину стандартной ошибки — M ± SD, медиан и квартилей — Me [LQ; UQ]. Сравнение количественных показателей проводили с применением непараметрических методов с использованием критериев серий Wald-Wolfowitz runtest, Mann-Whiney U-test. Для оценки силы связи (корреляции) между показателями был проведён корреляционный анализ по Spearman. За статистически значимые принимали различия при p < 0,05.

Средний возраст пациенток в исследуемой группе составил 43,4 ± 13,1, в контрольной группе — 24,4 ± 3,1 лет.

Результаты сравнительной оценки цитокинов в исследуемой и контрольной группах представлены в таблице 1.

Сравнение двух вышеуказанных групп показало следующие различия между ними по анализируемым показателям:

Таким образом, в ходе попарного сравнения были выявлены достоверные различия по параметрам CLP крови, CLP мочи, VEGF мочи и ИЛ-6 мочи. По остальным показателям достоверных различий выявлено не было.

Полученные данные свидетельствует о повышенном содержании кальпротектина в крови и в моче в исследуемой группе в сравнении с контрольной, но при этом критерий Стьюдента при сравнительной оценке уровня кальпротектина в крови приближен к 0,05, поэтому мы считаем, что диагностическую значимость и важность играет именно кальпротектин мочи (р = 0,000001). Кроме того, на уровень кальпротектина крови значительно влияет многие воспалительные заболевания других органов и систем.

Мы также провели корреляционный анализ среди всех шестидесяти женщин, принявших участие в исследовании. Учитывались VEGF крови, ИЛ-6 крови, CLP крови, CLP мочи, ФНО-альфа крови, VEGF мочи, ИЛ-6 мочи, ФНО-альфа мочи, лейкоцитурия и эритроцитурия.

Результаты корреляционного анализа (Spearman Rank Order Correlations) представлены в таблице 2 в виде значений коэффициента корреляции R и уровня достоверности р.

В исследуемой группе пациентов была выявлена прямая достоверная корреляционная связь средней силы между следующими показателями:

Кроме того, была выявлена прямая достоверная умеренная корреляционная связь между:

Также была выявлена прямая достоверная корреляционная связь слабой силы между параметрами:

Полученные данные указывают на то, что наиболее сильная корреляционная связь отмечена между симптомами и уровнем кальпротектина в моче и лейкоцитурией. Учитывая, что лейкоциты в осадке мочи представлены в основном нейтрофилами, которые способны вырабатывать кальпротектин, логично было предполагать, что источником кальпротектина в моче являются именно нейтрофилы. Острое воспаление, локализующееся в уротелии, ведёт к повышению уровня лейкоцитов в моче и, как следствие, кальпротектина и ИЛ-6. В таком случае диагностическая ценность определения уровня кальпротектина и ИЛ-6 в моче приравнивается к определению лейкоцитов в моче.

При попарном сравнении уровня цитокинов между исследуемой и контрольной группами достоверное различие по уровню содержания кальпротектина в моче было особенно выраженным, р=0,000001, в отличие от лейкоцитурии — р=0,003, поэтому был проведён сравнительный анализ в исследуемой группе, направленный на оценку различия уровней кальпротектина, ИЛ-6, ФНО-альфа, VEGF в крови и моче в зависимости от наличия или отсутствия повышенного содержания лейкоцитов в моче (табл. 3).

Согласно полученным данным, у женщин в исследуемой группе повышение уровня ИЛ-6 в моче ассоциировано с повышением содержания в ней лейкоцитов (р = 0,012), в то время как лейкоцитурия не связана с уровнями VEGF, ФНО-альфа, кальпротектина в крови и моче, ИЛ-6 крови.

Видеоцистоскопия с биопсией стенки мочевого пузыря позволила исключить злокачественные новообразования мочевого пузыря. В ходе морфологического исследования биоптатов хронический воспалительный процесс был обнаружен у всех 33 пациенток (100%), в 63,6% случаев (у 21 женщины) сочетался с плоскоклеточной метаплазией уротелия треугольника Lieto.

Нами установлено, что хроническое воспаление в стенке мочевого пузыря, в сочетании с рецидивирующей хронической тазовой болью, связанной с мочевым пузырем, сопровождающейся симптомами со стороны нижних мочевых путей, такими как учащённое мочеиспускание, императивные позывы к нему, дизурия, ургентное недержание мочи, ассоциировано с повышением уровня кальпротектина в моче независимо от содержания лейкоцитов в моче. Кальпротектин попадает в мочу при разрушении нейтрофилов или (в меньшей степени) макрофагов из воспаленной слизистой оболочки мочевого пузыря. При воспалительном процессе, сопровождающимся «оголением», или «денудацией», уротелия кальпротектин может проникать в просвет мочевого пузыря не только из уротелия, но из лежащих глубже его слоёв.

Данные нашего исследования свидетельствуют о том, что у пациенток с хронической тазовой болью, связанной с мочевым пузырем, сопровождающейся симптомами со стороны нижних мочевых путей, такими как учащённое мочеиспускание, императивные позывы к нему, дизурия, ургентное недержание мочи, имеющих подтвержденный хронический рецидивирующий цистит, воспалительный процесс присутствует в стенке мочевого пузыря даже при отсутствии патологических изменений в моче, а в области мочепузырного треугольника в большинстве случаев ассоциирован с наличием вагинальной метаплазии эпителия.

Переходноклеточный эпителий мочевого пузыря в норме не экспрессирует на своей поверхности S100A8/S100A9, соответственно, не образует кальпротектин. Доказано, что нормальный многослойный плоский эпителий способен экспрессировать S100A8/S100A9 в небольших количествах, но экспрессия может значительно увеличиваться при большом спектре различных воздействий, расцениваемых как опасность, например, при воспалении [13].

Частые обострения цистита могут быть связаны с дефицитом барьерной функции зонтичных клеток и / или нарушением регенеративной способности эпителия мочевого пузыря вследствие хронического субуротелиального воспаления, активации и усиления апоптоза уротелиальных клеток, ингибирования пролиферации базальных клеток и созревания апикальных клеток [13]. Мы обнаружили, что уровень VEGF повышен в моче у пациенток исследуемой группы; можно предположить, что это связано с имеющимися у них гипоксией и воспалением [14].

Но в то же время кальпротектин может представлять собой важный этап механизма положительной обратной связи в инициировании и усилении воспалительного процесса, поскольку непосредственно индуцирует синтез провоспалительных хемокинов и цитокинов [15].

В нашем исследовании в 63,6% случаев хронический воспалительный процесс в области мочепузырного треугольника был ассоциирован с неороговевающей плоскоклеточной метаплазией уротелия. В таком случае нельзя исключить ключевую роль в возникновении расстройств мочеиспускания и / или хронического процесса повышенной экспрессии S100A8/S100A9 на поверхности плоскоклеточного эпителия мочевого пузыря

Эту теорию подтверждает проведённый ранее транскриптомный анализ, показавший сверхэкспрессию генов в эпителии треугольника Lieto у девочек с расстройствами мочеиспускания, участвующих в пути антимикробных пептидов, в том числе S100A9 [16].

Можно предположить, что в ответ на действие неких «стрессовых» факторов плоскоклеточная, или «вагинальная», метаплазия уротелия, в некоторых (но не всех) случаях реагирует экспрессией генов S100A8/S100A9, что влечёт за собой развитие воспалительной реакции за счет действия кальпротектина [17]. Плоскоклеточная метаплазия уротелия часто ассоциируется с хроническим воспалением [18], предполагается, что вагинальная метаплазия не является следствием хронического воспаления, но ее наличие может предрасполагать к хронической инфекции [19].

При уротелиальной карциноме также отмечается экспрессия генов, которые, активируя воспаление в стенке мочевого пузыря, облегчают инвазивную способность опухоли. Процесс выработки кальпротектина в этом случае также не сопровождается пиурией [17].

Получается, что кальпротектин вполне может вызвать развитие абактериального воспалительного процесса в стенке мочевого пузыря без повышения уровня лейкоцитов в моче, в связи с чем особенно ценна и высока диагностическая значимость кальпротектина как маркера воспаления в стенке мочевого пузыря в случаях, когда анализы мочи в норме.

Результаты исследования показали, что у женщин с хроническим рецидивирующим циститом повышены уровни кальпротектина, VEGF, ИЛ-6 мочи, при этом лейкоцитурия не влияет на уровень кальпротектина и VEGF в моче. Кальпротектин может служить маркером воспаления в стенке мочевого пузыря, в том числе для оценки активности воспалительного процесса и / или оценки эффективности лечения. На наш взгляд, требуются дальнейшие исследования роли S100A8/S100A9 в развитии и поддержании воспалительного процесса в стенке мочевого пузыря при хронических рецидивирующих циститах.